一种基于荧光的方法用于研究感染组织中的细菌基因调控

该方法可以揭示细菌基因表达的空间模式以及细菌在宿主组织微环境中生理适应的策略，而这些信息在对整个组织中的细菌群体进行平均分析时会丢失。利用该技术可检测到潜在的异质性，这在鉴定可作为抗毒力或抗菌化合物靶点的新型细菌通路和蛋白质时必须予以考虑。首先，从冷冻甘油菌种中将感兴趣的金黄色葡萄球菌（S. aureus）菌株划线接种于血琼脂平板，于37°C培养16至24小时，通过观察其溶解红细胞并形成清晰透明溶血环的能力，确认其溶血表型。

将各菌株的单菌落分离物分别接种于装有4毫升胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）的无菌玻璃试管中，在37摄氏度下以约70度倾斜角、70转/分钟的转速于试管旋转仪中旋转培养16至24小时。次日，使用分光光度计测定培养物在600纳米处的光密度（OD600），并将菌液用无菌TSB稀释至OD600为0.05，总体积为25毫升，置于125毫升德隆烧瓶中，烧瓶体积与培养液体积比为5:1。将培养物置于37摄氏度水浴摇床中，以280转/分钟振荡培养，并在对数生长期收获菌体。

通过离心收集细胞，并用等体积的无菌 PBS 洗涤细胞两次。然后将细胞重悬于新鲜 PBS 中，调整浓度至每毫升含 1 × 10⁸ 个菌落形成单位，用于后续注射至受体动物。在适当的实验终点，将肾脏、心脏、肝脏、肺和脾脏采集至含有 10% 缓冲福尔马林的 15 毫升聚丙烯管中，在室温下避光孵育 24 至 48 小时，并轻轻振荡或旋转。

固定结束后，将器官包埋于透明组织冷冻介质中，于零下80摄氏度保存。使用冷冻切片机获取10 µm厚的组织切片，并将切片置于预先清洁的带电荷载玻片上，在避光条件下干燥20分钟，随后加入含DAPI的硬封片剂。然后加盖盖玻片，室温下避光过夜固化，再将样本转移至4摄氏度长期保存。

为了识别样本中的病灶，将玻片置于激光扫描共聚焦显微镜的载物台上，选用合适的物镜观察单个细胞，并采集病灶的图像。为测量共聚焦图像中的荧光强度，在 ImageJ 中打开图像，并调整亮度和对比度，以清晰显示病灶的荧光信号。使用多边形选区工具定义感兴趣区域，并在 ImageJ 的“编辑”选项卡下将该区域添加至 ROI 管理器中。

选择“编辑”，然后选择“选择”，最后选择“添加到管理器”。接着，重命名感兴趣区域（ROI）并标记相应的图像。为定义质心，打开“分析”选项卡，选择“面积”、“平均灰度值”、“质心”和“限定为阈值”。

提取中心点的荧光强度值，或测量给定病灶单位面积内的平均荧光强度。可通过使用阈值功能，根据需要设置荧光强度的下限和上限来实现。将数据导出至 Excel 文件，并准备一列用于标明病灶边缘和核心区域的单位面积平均荧光 intensity。

为了计算周边和核心区域单位面积的平均荧光强度，需手动设定阈值的上下限。携带融合基因的细胞中，金黄色葡萄球菌核酸酶GFP融合荧光强度平均比未携带报告融合基因的细胞高出近九倍。同样，串联二聚体番茄红荧光蛋白融合荧光强度约为无报告基因对照的六倍。

可通过流式细胞术检测组织匀浆中的报告基因活性模式来确认其表达情况。尽管荧光信号的倍数差异通常较低，但荧光测量值的变异可能源于报告基因表达的异质性。

例如，在这些代表性样本中观察到，某些病灶在相同组织样本中距离约100微米范围内表达出一种或两种报告基因。在金黄色葡萄球菌脓肿群落中，以单细胞分辨率检测报告基因活性，揭示了金黄色葡萄球菌耐热核酸酶在强DAPI染色所界定的脓肿区域中存在空间性调控表达，可能与中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps）的形成和释放相关。例如，与位于外围区域相比，金黄色葡萄球菌耐热核酸酶GFP融合蛋白的荧光信号在脓肿群落内部核心区域显著更强。

在同一脓肿中，串联二聚体番茄荧光蛋白融合荧光的模式似乎呈倒置状态。然而，本实验中的该模式在统计学上无显著性差异。获得完整的冷冻包埋切片对于荧光图像分析至关重要，应谨慎操作。

对细菌细胞进行分选以捕获不同程度表达融合蛋白的亚群，结合RNA-Seq分析，可揭示转录组范围内的全基因组变化。操作甲醛时需格外小心，因其为致癌物，直接接触可能引起皮肤刺激、过敏反应或眼部损伤。构建携带目标荧光报告基因的菌株的突变衍生物，有助于揭示所观察到的空间调控模式的遗传基础。