通过腺相关病毒（AAV）衣壳变异体的改造、条形码标记与筛选分离下一代基因治疗载体

本方案通过实现病毒的工程化改造、多样化和分层，填补了病毒自然进化与其作为人类基因治疗中重组载体应用之间的显著空白。该技术能够对新型、分离获得或工程化改造的腺相关病毒（简称AAV）变体进行高通量并行筛选，从而减少动物使用数量、工作量、成本和时间。所鉴定出的AAV衣壳变体可提高基于AAV的治疗性转基因递送的效率和特异性，进而降低所需的病毒剂量。

这可能会提高基因治疗的安全性和适用性。相同的方法也可用于其他基因递送载体的衣壳或启动子工程，从而增进我们对其生物学特性的理解，并提升其在基因治疗中的应用。演示该实验操作的人员包括我实验室的博士生Jonas Becker和Jixin Liu、博士后Joanna Szumska和Margarita Zayas，以及研究助理Emma Gerstmann和Ellen Widtke。

首先使用 Python 3 和 Biopython 分析 NGS 测序数据。NGS 分析包含两个步骤。第一步，使用脚本一和提供所需信息的配置文件，在序列文件中搜索满足特定条件（如侧翼序列、长度和位置）的序列。

第二步，使用脚本二以及提供所需信息的配置文件和 zuordnung.txt 文件，从 AGWGGC 序列开始翻译提取出的序列。准备两个文件夹：script 和 data。

将测序产生的 Gzip 压缩文件复制到数据文件夹中。然后按照文稿中的描述，将 Python 文件和配置文件复制到脚本文件夹中。在运行脚本之前，打开 zuordnung。

txt 文件中添加两列以制表符分隔的列。在第一列中输入 Gzip 文件的名称，在第二列中输入期望的最终名称。根据文稿中的描述修改配置文件中的变量。

使用特定命令，启动变异序列的检测与提取。输出结果为包含提取出的DNA序列及其读段数量的TXT文件。该文件的头部包含统计信息，这些数据将被传递至后续文件中。

这些 TXT 数据将作为第二个脚本的输入文件，用于进行 DNA 序列的翻译、排序和分析。使用特定命令，按照文本手稿中的描述，启动对第一个脚本文本输出文件的 PV 翻译与分析。第二个脚本的输出文件将根据 zuordnung 中查找表的第二列来命名。

txt 文件的扩展名取决于分析类型。确保三个输出文件的前几行包含统计信息，并且第一列包含输入文本文件中每条 DNA 序列的索引。其余列应包括 DNA 序列、读段数量、正向或反向读段以及翻译后的肽序列。

无效序列在最后两列中应显示为 NA 且标记为无效。根据用户需求，使用可用软件对输出文件进行可视化。为了使用 Python 3 中的自定义代码分析 NGS 测序数据，该工作流程包括根据侧翼序列、长度和位置来检测条形码序列，以及分析条形码在各组织样本中的富集情况和分布情况。

准备两个文件夹：script 和 data。将测序产生的 Gzip 压缩文件复制到 data 文件夹中。然后按照文稿中的描述，将 Python 文件和配置文件复制到 script 文件夹中。

在执行脚本之前，创建两个以制表符分隔的文本文件：一个为 capsidvariance.txt 文件，其中包含分配给 AAV 衣壳变异体名称的条形码序列；另一个为 contamination.txt 文件，其中包含可能来自污染的条形码序列。

最后，编辑配置文件，包含测序数据文件夹路径、条形码侧翼区域序列、其位置以及条形码检测的窗口大小等信息。使用相应命令，结合提供的路径和配置文件执行条形码检测脚本。该命令执行后的输出结果为 TXT 文件，其中包含每个衣壳变异体的计数以及从原始数据中回收的总读段数。

为了评估条形码标记的 AAV 衣壳在组织或器官中的分布情况，请在 zuordnung.txt 文件中，将条形码检测运行所获得的每个文本文件的名称分配给相应的组织或器官名称。将文本文件的名称填入第一列，并在以制表符分隔的分配表中填入对应的组织或器官名称。

创建一个 organs.txt 文件，其中包含靶器官和非靶器官的名称列表，这些名称需与 assignment zuordnung.txt 文件中给出的名称相对应。

然后创建以制表符分隔的文本文件 normalization_organ.txt 和 normalization_variant.txt，其中包含所有衣壳变异体以及所有器官和组织的标准化数值。

在第一列的 normalization_organ.txt 文件中，填写每个器官对应的名称，在第二列填写相应组织的标准化数值。填写 normalization_variant 的第一列。

包含衣壳名称列表的txt文件，以及第二列中每个衣壳在混合文库中标准化后的读段计数值。通过指定所有附加文件的完整路径来编辑配置文件，并使用特定命令执行条形码分析脚本。条形码分析脚本会输出多个文件，例如基于前述多种标准化步骤生成的不同组织中衣壳分布相对浓度（RC值）的文本文件，以及将文本文件数据整合为合并矩阵数据的电子表格文件。

按照文稿中所述方法对矩阵数据进行可视化并执行聚类分析。该脚本将读取 relativeconcentration.xls 文件，并生成两幅图：层次聚类热图和主成分分析图。

如需修改图表或PNG参数，请打开R脚本并按照注释部分的说明进行操作。AAV2 rep基因的定量区域显示，99.2%的样本ITR呈阳性，表明AAV衣壳中含有完整的病毒基因组。在所有三组样本中，基于文库特异性特征序列提取的读段约占总读段的94%，表明文库质量良好。

其中，超过 99% 为有效的 PV 读段，且超过 99% 的有效 PV 读段是唯一的，表明文库具有高度的内部多样性且分布均衡。热图层级的两个主要分支反映了不同衣壳变体在转导效率上的差异。左侧分支包含了大多数衣壳变体，其中包括在大多数组织中表现出较高相对浓度值的所有衣壳。

除了显著的高肝脏特异性外，另外三种衣壳在膈肌、骨骼肌、肱二头肌和脑组织中也表现出特异性。层次聚类的右分支包含整体转导效率较低的衣壳变体，这在十二指肠和胰腺中尤为明显。对原始子集进行的主成分分析形成了具有高肝脏特异性的衣壳变体簇，并凸显了VAR60衣壳在肌肉组织中突出的趋向性。

在尝试本方案时，需注意避免输入错误。若使用 Windows 命令提示符与 Linux 系统，其语法亦有所不同。在鉴定出新的 AAV 变体后，需在死亡个体或更大的动物模型中验证其治疗潜力和转化应用价值。

该技术能够在相同条件下直接对AAV变异体进行并行比较，具有极高的通用性，为其在大型动物甚至人类中的应用奠定了基础。