通过调整静电纺丝工艺为三层结构提供三种独特环境 体外 气道壁模型

本实验的总体目标是通过电纺技术制备一种三维相分离支架，以实现完全分化的成人人类细胞的共培养，从而模拟这些细胞在C2中所接触的天然细胞外基质。该目标首先通过电纺制备随机取向的微纤维支架来实现；第二步是在微纤维支架上直接电纺一层随机取向的纳米纤维，从而形成双相支架。

接下来，制备一种独立的取向纳米纤维支架，通过静电纺丝形成。最后一步是将每种支架分别接种相应的细胞类型，并在灌注式生物反应器系统中作为单一整体进行共培养。最终，可通过检测介质释放和免疫染色来分析多细胞间的相互作用。

该构建体。与现有的二维转化膜等方法相比，该技术的主要优势在于电纺支架能够提供一种三维纤维环境，可被调整以形成具有生理相关性的形态结构。其结构更具多孔性，并允许多种细胞类型进行核心共培养。

该方法利用分组的、患病的或健康的原代人类细胞，提供了一个稳定的体外研究平台。这将有助于减少对动物模型的依赖，因为动物模型在模拟人类疾病方面存在局限性，同时也能减少实验中所使用的动物数量。尽管该方法可用于研究哮喘和慢性阻塞性肺疾病（COPD）等疾病，但它也可应用于其他系统，例如用于肠道炎症性疾病的研究，或用于构建皮肤模型以进行化学物质测试。

首先，制备三种不同的 10 毫升 PET 溶液，分别将 8%、10% 和 30% 的 PET 溶解于氯甲烷与三氯乙酸的 1:1 混合液中。室温下搅拌过夜，使 PET 充分溶解。次日，将 PET 溶液转移至注射器中，并为装有 8% 溶液的注射器连接 23 号针头，为装有 10% 和 30% 溶液的另外两个注射器分别连接 18 号针头。

制备微纤维支架。首先，将装有30% PET溶液的注射器装入注射泵，使针尖朝下。将金属鼓置于距针尖15厘米处，并确保针尖对准金属鼓的中心。

使用金属鳄鱼夹将正极电源线连接到针尖，并通过将接地线连接到香蕉插座来接地纺丝装置。打开电机，将纺丝装置转速设置为 60 RPM。开启注射泵，使流速为 2.0 毫升每小时。

在制备微纤维支架时，启动泵直至溶液从针尖挤出，以排出针内空气、完成系统的预填充。随后停止注射泵的运行。

将待排出溶液的总体积设定为2毫升并启动泵。接着，在针头与芯轴之间施加14千伏的电压，电纺1小时，直至2毫升的30% PET溶液完成电纺，此时微纤维支架仍留在芯轴上，随后关闭电压。取下鳄鱼夹，并将装有30% PET溶液的注射器更换为装有8% PET溶液的注射器。

然后将鳄鱼夹重新连接到23号针头上。将注射泵的流速调整为0.5毫升/小时，并启动注射泵，使溶液从针尖流出，以对针头进行预灌注。保持芯轴以60转/分钟持续旋转，在针尖与芯轴之间施加14千伏的电压，并将注射泵需挤出的总体积设定为2毫升。

电纺持续四小时，直至8% PET溶液中有两毫升被电纺完成。电纺结束后，关闭电源和带动心轴旋转的电机。沿心轴宽度方向用刀片切割双相支架，得到一片尺寸与心轴表面积相同的二维支架薄片。

为制备取向的PET支架，将装有10% PET溶液的注射器装入注射泵中，并使针尖朝下。然后将鳄鱼夹连接到针头上。设定流速为0.5毫升每小时，并用PET溶液预润针头。

然后启动电机，将芯轴转速设定为 2000 RPM。接着打开注射泵，将电压源设定为 14 千伏，并开启电源，进行四小时的静电纺丝，直至两毫升溶液完成静电纺丝。

电纺完成后，关闭电源和电机。沿 mandrel 的宽度方向用刀片将支架切割，以获得排列整齐的二维支架片。将电纺支架存放在铝箔中，以减少静电荷。

使用直径为0.8毫米的活检打孔笔从SPU片材中切取双相或定向支架的圆片。然后使用无毒水族胶将双相支架圆片粘附到垫圈上。将垫圈和支架放入12孔组织培养板中。

使用紫外线 I 辐射对支架的每一侧进行 30 分钟灭菌处理。然后在 20% 抗生素-抗真菌溶液中于 4 摄氏度下浸泡过夜，次日用 PP S 洗涤支架 3 次，并将支架置于磷酸盐缓冲液（PBS）中于 4 摄氏度保存，直至使用。

将双相支架从 PBS 中转移至新的 12 孔板中，加入含 10% FCS 的 DMEM 培养基，在 37 摄氏度下预热一小时。移除补充了成分的 DMEM 培养基，将支架的微纤维面朝上，每孔支架上滴加含 15,000 个 MRC-5 成纤维细胞的 30 微升补充培养基，以促进成纤维细胞渗入支架。将培养板置于轨道摇床上，以 100 RPM 振荡两小时。

然后向每个支架中加入2毫升添加了补剂的DMEM培养基，并在37摄氏度、5%二氧化碳条件下将支架孵育过夜。次日，移除孔中的培养基，将支架翻转，使支架的纳米纤维层朝上。随后，在30微升含有10%胎牛血清（FCS）的D-M-E-M-F12培养基中加入30,000个Cali-3上皮细胞，接种至支架的纳米纤维层表面。

将支架在37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育2小时，然后将支架浸入由D-M-E-M-F 12和DMEM补充培养基按70:30比例混合的培养液中，继续静态孵育额外12小时，以培养气道平滑肌细胞。首先，将排列好的支架从PBS中转移至新的12孔板中，并在37摄氏度下预热支架和DMEM补充培养基1小时。吸除DMEM补充培养基，向每个支架加入含25,000个气道平滑肌细胞的30微升DMEM补充培养基，于37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育2小时。

连接后，将支架浸入添加了补充剂的 DMEM 培养基中。随后放回培养箱，过夜培养，再在生物反应器中建立三重共培养体系。次日，将双相种子支架放入生物反应器腔室中，使上皮相朝上面对腔室。

然后将对齐的支架放置在双相支架下方，使其与双相支架的微纤维相部分相邻。将生物反应器的两个腔室锁紧固定。随后，按照随附的文字版实验方案，在培养箱内组装两个灌注流路系统，并在一周后使用蠕动泵以大约 0.1 毫升/分钟的流速使培养基在两个回路中循环流动。

从顶端腔室中移除培养基并进行培养。在生物反应器中培养两周后，再于气液界面继续培养上皮细胞一周，随后进行分析。此处所示的三重共培养支架经固定和切片，以显示细胞核在整个构建物所有三层中的分布情况；细胞核经DPI染色后呈蓝色，支架材料则呈灰色。以下是用于接种上皮细胞、成纤维细胞和平滑肌细胞的电纺纳米纤维、微米纤维及定向排列支架的扫描电子显微镜图像。

三种细胞类型在各自支架上培养两周后均表现出活力的增加。在两周的培养期后，它们各自继续表达细胞类型特异性的蛋白质。在尝试该操作时，重要的是要记住研究你试图通过电纺纤维重建的天然细胞外基质。

细胞在附着于不同三维形貌时会表现出不同的行为。例如，上皮细胞只有在纳米纤维上培养时才能形成功能性屏障。观看本视频后，您应能充分理解如何构建一种多层共培养系统，该系统可用于动态培养环境中细胞间相互作用的研究。

请务必注意，在执行此操作时，需要根据所使用的聚合物和溶剂体系，优化静电纺丝参数，例如流速和电压。这对于获得理想的纤维结构至关重要。此外，应记住在通风橱或通风柜中进行静电纺丝，以便有效排出溶剂蒸气。