成像引导式生物反应器用于生成生物工程化气道组织

本方案允许在体外培养分离的气道组织，并在不同的组织操作过程中（如去上皮化和气道组织再生）实现直接的显微观察。本研究提出的原位成像方法可在成像引导下对内源性上皮进行可控去除以及外源性细胞递送的过程中，快速、无损地监测气管管腔的变化。该成像引导的生物反应平台及组织操作方案可用于构建生物工程化气道组织，以用于疾病建模和药物筛选。

本研究团队的两名博士生 Mohammad Mir 和 Jiawen Chen 将演示成像功能气道组织生物反应器的构建与使用。要开始制作原位成像装置，请将一个管镜插入可堆叠的镜筒中，并使用固定环将其固定。然后，通过 C 型接口适配器将镜头支架组件安装到科学级 CMOS 相机上。

使用 Micromanager 软件操作相机以采集照片和视频。当对准位于相机 10 米处的物体时，调节筒镜与相机成像传感器之间的距离，直至计算机屏幕上形成该物体的清晰图像。接下来，使用光学笼式系统组件（如安装杆、螺纹笼板和笼式立方体），将滤光镜安装到双边缘超分辨率二向色镜上，并将激光器连接至装置。

将20倍物镜连接到设备上。然后，通过X-Y平移装置将直径为500微米的绿色透镜安装在透镜管的远端。调节绿色透镜与物镜之间的距离，以形成聚焦的显微图像。

为了在明场或荧光下观察分离的大鼠气管管腔，将生物反应器置于成像载物台上。接着，通过连接气管插管管路的注射泵，以每分钟5毫升的流速向气管内灌注500微升新配制的羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）溶液。当CFSE溶液充满气管后，停止泵送。

10分钟后，使用注射泵向气管腔内注入10毫升磷酸盐缓冲液（PBS），以冲洗未结合的CFSE试剂残留物。清洗后，将绿色镜头的远端成像端通过连接在气管一端的鲁尔接头插入气管内。然后，轻柔地在气管内移动绿色镜头，直至气管表面清晰对焦。

在 Micromanager 软件中捕获明场图像时，通过笼式立方体（cage cube）以白光照射气管管腔。然后，单击“实时”（Live）图标，实时显示气管的管腔表面。使用“成像设置”（Imaging setting）和“曝光”（Exposure）选项卡，将曝光时间调整至所需数值。

为调整图像的对比度和亮度，请使用直方图和强度缩放窗口，移动交互式直方图显示末端的黑色和白色箭头。单击“停止实时”以激活“捕获”图标，然后单击“捕获”图标以冻结图像。接下来，使用“导出”设置，然后选择“图像”作为独立选项卡，以所需格式保存图像。

为了以荧光模式获取图像和视频，通过笼式滤光立方体用CFSE特异性激光照射气管腔，并通过前后移动成像探头实时采集图像。获得图像和视频后，轻柔地将绿色镜头从气管上取下。进行气管去上皮化时，经气管插管注入50 µL新配制的2%十二烷基硫酸钠，使去垢剂溶液在气管腔内形成一层薄膜。

灌注后，使用公或母鲁尔接头堵头封闭生物反应器的管路连接处，并将生物反应器转移至37°C培养箱中孵育10分钟，使SDS在气管内停留。重复灌注一次。第二次灌注后，通过注射泵以每分钟10毫升的流速，用500微升磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗气管腔三次，以去除裂解的上皮组织和SDS。

然后，将生物反应器置于摇床上，以20赫兹的频率和0.3毫米的位移振幅进行机械振动，以促进经SDS处理的上皮细胞从气管腔中物理脱离。在气管机械振动的同时，通过气管腔分两次注入各500微升的PBS，以去除残留的SDS和细胞碎片。上皮层去除后，使用绿色荧光成像装置检测CFSE的荧光强度，评估上皮层的清除情况。

制备去上皮化的 大鼠气管后，将冻存的间充质干细胞（MSCs）在 37°C 水浴中解冻 30 秒。随后使用血细胞计数板对细胞进行计数，并配制浓度为 5 × 10⁶ 个细胞/毫升的细胞悬液。然后，在室温下用 2 毫升 100 微摩尔的 CFSE 溶液孵育细胞，对细胞进行荧光标记。

孵育15分钟后，用5毫升PBS洗涤细胞三次，然后将细胞重悬于新鲜DMEM培养基中，终浓度为每毫升3×10⁷个细胞。按照文章中所述方法制备I型胶原水凝胶后，立即将细胞以所需浓度加入水凝胶溶液中。随后，使用微量移液器将细胞与凝胶溶液混合，以获得均匀的细胞-水凝胶混合物。

接下来，通过鲁尔接头将生物反应器内气管的一端连接至可编程注射泵，并以37摄氏度的温度向生物反应器腔室中注入5毫升新鲜培养基，以覆盖气管的外表面。然后，向生物反应器内去上皮化的气管中注入10微升的细胞-水凝胶混合物，以在气管管腔内形成一层细胞-水凝胶层。细胞注射完成后，立即将生物反应器置于37摄氏度、5%二氧化碳的无菌细胞培养孵箱中，孵育30分钟，以促进凝胶化。

为了观察植入细胞的分布情况，使用70%异丙醇或乙醇对绿色镜头进行灭菌，将生物反应器置于成像平台上，以获取明场和荧光模式下的照片和视频。细胞接种30分钟后，以每分钟1毫升的流速向气管腔内灌注1毫升培养基。最后，将接种细胞的气管置于生物反应器中，在37°C的培养箱中培养至所需时间。

在细胞培养过程中，保持管腔内的培养基静止，而气管外的培养基则通过单向流动持续灌注。在去上皮化气管的明场和荧光图像中，CFSE标记前未观察到荧光信号。使用CFSE后，上皮组织中 throughout 观察到均匀的荧光信号。

去上皮化后，荧光强度显著降低，表明上皮已被清除。去上皮化气管的苏木精-伊红染色显示，气管腔内的假复层上皮已被去除，而下层组织中的细胞及细胞外基质（ECM）微结构得以保留。此外，五色染色和三色染色证实了气管组织结构以及细胞外基质成分（如胶原蛋白和蛋白聚糖）的完整性。

上皮细胞和胶原蛋白I的免疫荧光结果显示，上皮层被完全去除，而上皮下组织中的胶原蛋白I得以保留。扫描电子显微镜图像显示，天然气管组织中分布有多个纤毛细胞和杯状细胞。在去上皮化的气管中，基底膜暴露，表现为细胞外基质纤维形成的网状结构，并且无上皮细胞存在。

此处展示了经脱上皮处理的气管在使用 PBS 和胶原蛋白接种后的荧光图像。与通过培养基接种的细胞相比，通过水凝胶递送的荧光标记细胞在管腔内壁上的黏附更为均匀。细胞活力研究表明，细胞递送过程未对细胞活力产生影响，超过 90% 的细胞保持存活状态。

在去上皮化过程中形成一层薄薄的去污剂膜，并使用水凝胶作为细胞递送载体，是本方案成功的关键步骤。我们下一步的研究目标是将实验室培养的气道原代细胞或干细胞植入去上皮化的气道组织，以探究是否能够构建出具有功能的气道组织。