库普弗细胞分离用于纳米颗粒毒性检测

以下实验的总体目标是分离并大量纯化小鼠库普弗细胞，以研究纳米颗粒的毒性。该目标通过使用H-B-S-S-E-G-T-A溶液和胶原酶溶液灌注小鼠肝脏，轻柔消化肝组织来实现。随后，通过密度梯度离心和选择性贴壁法对肝细胞进行纯化，从而获得纯化的库普弗细胞培养物。

然后进行流式细胞术分析，以确认杯状细胞的纯度及其酸性特性。获得的结果表明，功能化碳纳米管的毒性可以在杯状细胞中进行测量。根据改良的乳酸脱氢酶释放实验（L-D-H-S-A）结果，表明该模型可用于纳米颗粒毒性检测。

我们今天要向您展示的方法有助于回答纳米毒理学领域的关键问题，例如评估新开发的药物载体的毒性。这一点非常重要，因为目前使用的大多数永生化细胞系与其来源组织具有显著不同的特性。该方法的可视化演示至关重要。如果该方法成功实施，将能够获得高产量和高纯度的角质形成细胞（ke cells），这些细胞随后可作为模型用于筛选多种纳米颗粒的毒性。

根据随附文本方案中列出的材料与试剂表，将所有试剂新鲜配制后，将E-G-T-A-H-B-S-S溶液和胶原酶溶液在40摄氏度下预热30分钟，并用70%乙醇冲洗泵的柔性管路。然后将40毫升E-G-T-A-H-B-S-S溶液倒入浸没于水浴中的离心管中，并用预热的E-G-T-A-H-B-S-S溶液冲洗泵的柔性管路。按照文本方案处死一只CD1小鼠后，剃除腹部毛发，并用70%乙醇对腹部表面进行消毒。

通过夹捏脚趾确认麻醉效果。切开腹腔，将肠道向腹部左侧横向移开，暴露门静脉和下腔静脉。使用 E-G-T-A-H-B-S-S 溶液，以每分钟 1 至 3 毫升的速度启动泵，用 23 号蝶形针穿刺门静脉，夹闭穿刺部位的门静脉，然后翻转开口小鼠腹部表面的弯头镊。

灌流开始后的前30秒内，肝脏应迅速变苍白；此时应快速切开下腔静脉的下部，以避免肝脏内压力过高，并在灌流的第一分钟内逐渐将流速增加至每分钟7毫升。当离心管中剩余的EGTA-HBSS溶液少于5毫升时，加入40至50毫升的胶原酶A溶液，然后在30秒内将流速逐渐增加至每分钟10毫升。

使用镊子定期对下腔静脉施加压力，持续10至32秒的时间间隔，使肝脏膨胀。这将改善细胞解离效果，并缩短胶原酶灌注时间。当离心管内胶原酶溶液剩余不足10毫升时，向管中额外加入40至50毫升预热的胶原酶溶液。

当灌注量达到 70 至 80 毫升时，用镊子轻轻按压肝脏表面，若出现凹陷痕迹，则表明肝细胞已解离。将肝脏完整地从腹腔中取出，并置于含有 20 至 30 毫升细胞分离培养基的离心管中。

将肝细胞置于冰上保存最多三小时，并可合并最多三个肝脏进行细胞纯化。取一个灌注后的肝脏放入培养皿中，加入15毫升用于细胞分离的培养基，用剪刀或镊子操作。撕破肝脏的光泽囊膜，使所有肝细胞释放到培养基中。

将溶液通过100微米细胞滤筛过滤至离心管中。随后在4摄氏度条件下以50 ×g离心2分钟。实质细胞将位于沉淀中，而非实质细胞则位于上清液中。

将上清液收集到一个干净的离心管中，在50 ×g 条件下离心2分钟。重复操作，共进行四次转移和离心。接下来进行离心。

在1,350 ×g下离心15分钟。为沉淀非实质细胞，弃去上清液，将沉淀物重悬于10 mL用于细胞分离的培养基中，将非实质细胞悬液加入先前根据文本方案制备的25%/50%等渗密度梯度中，在无加速度和无刹车条件下以850 ×g离心15分钟。使用10 mL血清移液管吸取约12 mL富集的肝实质细胞组分，该组分呈浑浊状，位于25% SIP组分内，靠近25%/50% SIP界面处。

将细胞转移至含有35至40毫升用于细胞分离的培养基的离心管中，轻轻混匀，然后在4°C条件下以1,350 ×g离心，使细胞沉淀。弃去上清液，加入5至10毫升预热的培养基，用血细胞计数板重悬细胞。用台盼蓝染色法计数细胞并测定细胞活力。将纯化的非实质细胞以每孔5×10⁵个细胞的密度接种于24孔板中。

将细胞置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育30分钟。然后轻轻移除培养基。用预热的HBSS洗涤细胞，并更换为每孔500 µL新鲜预热的细胞培养基。

将细胞放回37摄氏度环境中至少四小时，以使细胞在纳米颗粒处理前充分贴壁。在根据文本方案完成细胞纯度和吞噬活性的表征，并按照所述步骤与功能化碳纳米管（fcts）共孵育后，弃去上清液，每孔加入200微升裂解缓冲液。在37摄氏度孵育30至60分钟，进行剧烈吹打，将裂解后的细胞收集至微量离心管中。

然后在20,000 ×g条件下离心10分钟，以去除细胞摄取后残留的细胞碎片。将上清液收集至微量离心管中，并在-20摄氏度下保存。或者，取50微升上清液加入96孔板中，再加入等体积的乳酸脱氢酶检测试剂盒中的底物混合溶液。

设置三份含有50 µL裂解缓冲液和50 µL底物混合溶液的空白孔。然后用盖板密封，室温孵育15分钟，再加入50 µL终止液。最后在酶标仪中于490 nm处读取吸光度，并使用以下公式计算细胞存活率百分比。

该图显示，每只小鼠和三联样本中纯化的非实质细胞数量在八千万至一亿四千万个细胞之间。蓝色染色表明细胞活力约为95%。细胞在培养30分钟后，贴壁细胞呈圆形，4小时后细胞开始铺展并形成簇状结构，如图所示。

细胞经F四80抗体染色以检测巨噬细胞纯度，流式细胞术检测显示纯度高于95%。此外，培养12小时后，流式细胞分析显示85%的细胞具有酸性磷酸酶活性，表现为能够吞噬1微米的荧光微珠。然而，培养72小时后，具有吞噬能力的细胞比例下降至40%，如图所示。

与未处理细胞相比，经功能化碳纳米管孵育24小时和72小时的细胞杯形态相似。相反，以10% DMSO作为阳性对照处理的细胞杯在改良LDH检测分析中表现出坏死形态；经10% DMSO处理24小时和72小时的细胞杯显示出较高毒性。相比之下，当细胞暴露于50微克/毫升浓度达72小时时，fcts仅引起细胞活力轻微但显著的下降。采用该方法，可利用分离的ke细胞对其他基于细胞的SC以及所有类型的纳米颗粒进行测试。

这能够在减少动物使用的同时获得可靠的数据。我们希望该技术能够帮助纳米科技心理学领域的研究人员，为日益增多的新型纳米载体的安全性筛选铺平道路。