原代人肝细胞及其主要非实质肝细胞群的分离方案

该方法有助于解答肝病学和毒理学领域的关键问题，并为我们提供开发新型体外共培养和组织工程肝脏模型的机会。这种新技术的优势在于能够从同一供体和同一小块肝组织中分离出所有的肝细胞群体。开始此操作时，需在无菌条件下称取 freshly dissected 的肝组织，并将肝组织样本置于超净工作台内。

然后将组织样本表面的血液清理干净。接着使用1倍灌注液一冲洗套管。利用组织胶将套管的橄榄头固定在较大的血管中。

然后，测试灌注情况并检查套管是否存在泄漏。随后，使用组织胶将所有渗漏出澄清1X灌注液的血管封闭。之后，将插管后的肝组织样本放入布氏漏斗中。

然后，根据所使用的套管数量和肝组织的阻力，将蠕动泵的流速设定在每分钟 7.5 至 14.6 毫升之间。灌注组织直至全血完全冲洗出来，灌注时间至少 20 分钟，最长不超过 30 分钟。在某些情况下，可能需要用塑料夹夹闭其中一个套管，或用刮勺轻轻按压肝包膜以增加某一区域的内部压力，从而优化灌注效果。

从棕红色完全变为浅棕色或浅黄色表明灌注效果良好。随后，将灌注液更换为含有胶原酶P的消化液，然后调整装置以进行消化步骤。接着，使消化液进行循环流动，持续最长15分钟。

定期停止灌注并检查消化程度。当肝组织样本消化充分时，必须立即停止消化液的灌注。待样本准备好后，将其从装置中取出，并放入玻璃培养皿中。

用冰冷的终止液冲洗组织样本的外表面。从肝组织样本上移除套管。然后，使用手术刀在套管附着区域的中部切开肝组织样本，注意保持格利森氏囊完整。

用终止液冲洗组织样本内部，然后将整个组织样本浸没于终止液中。接着，轻轻振荡组织，以使细胞从组织中释放出来。随后，收集细胞悬液，并通过纱布漏斗过滤至10个50毫升塑料管中。

向肝组织样本中继续加入终止液，直至总体积达到500毫升。随后，离心细胞悬液，收集上清液以备后续非实质细胞（NPC）分离使用，并将细胞沉淀汇集至250毫升塑料管中。接着，用PBS洗涤细胞沉淀。

为此，离心细胞悬液。收集上清液，合并沉淀，并将沉淀重悬于肝细胞孵育培养基中。然后，使用台盼蓝染色法测定所得细胞悬液中的细胞数量和细胞活力。

为了分离非实质性的肝细胞，将收集的上清液离心以去除残留的红细胞和肝细胞。收集上清液并离心两次，以获得用于沉淀肝星状细胞（HCS）、肝内皮细胞（LEC）、部分库普弗细胞（KC）以及剩余库普弗细胞的细胞沉淀。接着，将沉淀重悬于HBSS中。然后，通过将密度梯度溶液与PBS混合，分别配制25%和50%的密度梯度，用于密度梯度离心。

将25%密度梯度溶液小心地加在50%密度梯度溶液层的上方。随后，将NPC悬液小心且缓慢地加在25%密度梯度溶液层的上方，以实现两层之间的清晰分离。在密度梯度上对细胞悬液进行离心，离心过程中不得减速停顿。

NPC 位于 25% 与 50% 密度梯度层之间的界面处。吸除最上层的死细胞和细胞碎片，并小心收集界面层。经过两次离心后，对 KC 和 MPC 组分进行细胞计数。

然后，采用先前所述的双步离心法对NPC组分进行离心，并将NPC重悬于Kupffer细胞接种培养基中。将含有KC的组分以每平方厘米5 × 10⁵个KC的密度接种至塑料细胞培养容器中。将KC培养物置于37°C、5% CO₂的湿化培养箱中孵育20分钟。

原代KC应在短时间内贴附于细胞培养塑料表面。随后，收集含有未贴壁NPC的上清液，其中主要包含LEC和HSC。为分离LEC与HSC，首先对上清液进行离心。

然后用 PBS 洗涤沉淀。第二次离心后，将细胞重悬于星状细胞-内皮细胞分离培养基中，并对所有剩余细胞进行细胞计数。接着，将一千万个细胞重悬于一毫升星状细胞-内皮细胞分离培养基中。

然后，加入20 µL MAX试剂盒中的封闭液和20 µL CD31微珠用于免疫标记，将所得悬液在4°C温度下孵育15分钟。随后，按照磁性激活细胞分选系统MAX的制造商说明书所述，将LEC与HSC分离，并收集HSC组分。洗脱磁性保留的CD31阳性LEC，并将其悬浮于星状细胞内皮细胞培养基中。

此处这些图像显示了分离后直接在相差显微镜下观察到的不同肝细胞群体。这组图像展示了细胞分离后培养24小时的细胞状态。此处展示了基于免疫荧光的不同细胞组分的表征结果。

分离后24小时，PHH对肝细胞标志物CK18呈阳性信号，KC对标志物CD68呈阳性信号；分离后72小时，LEC对波形蛋白（vimentin）呈阳性信号，HSC对GFAP呈阳性信号。在进行该操作时，需注意成功的细胞分离依赖于肝脏组织样本的充分消化。观看本视频后，您应能够充分掌握如何控制消化过程以及如何进行密度梯度分离，这两项是该操作的关键步骤。

该技术问世后，为医学研究领域的研究人员探索新建立的体外细胞培养和组织工程肝脏模型中的肝功能与肝病铺平了道路。