一种改进的小鼠原代肝细胞分离的省时高效方案

小鼠原代肝细胞在肝脏研究中具有重要意义，尤其是在葡萄糖代谢和肝脏药物测试方面。然而，其分离过程耗时较长，且能量消耗较大。

该方案可提供一种高效分离小鼠原代肝细胞的方法。该方法节省时间和劳力，所需步骤极少，且所有试剂均可商业获取。

首先使用蠕动泵以每分钟 4 mL 的速度泵入预热的双蒸水，持续 5 分钟。随后将泵管从双蒸水切换至预热的灌注培养基，并注意观察水与灌注培养基之间的气泡。

有助于追踪灌注液在系统中的流动情况。接下来，用70%乙醇对一只8周龄C57黑6J雌性小鼠的腹部进行消毒。然后使用剪刀切开腹部，暴露肝脏、门静脉和下腔静脉。

然后停止蠕动泵。在确认泵管中充满灌注液而非水后，将一根24号导管插入下腔静脉。

重新启动泵并切开门静脉。在灌注液泵入的同时，每隔一分钟按压一次门静脉，以使液体到达肝脏的每个角落。持续泵入约三到五分钟，或直至流出的液体变得澄清为止。

接下来将灌注管从灌注培养基更换为胶原酶-分散酶培养基。每隔一分钟按压一次门静脉，使液体到达肝脏的每个角落。持续灌注，直至25 mL胶原酶-分散酶培养基完全用尽。

接下来，分离出不含胆囊的完整肝脏，并将其置于冰上的培养皿中含30 mL洗涤液的环境中。用镊子将肝脏撕碎，以释放原代肝细胞进入溶液中。

在此阶段，洗涤液会变成含有释放出的原代肝细胞和小块肝组织的浑浊溶液。将此浑浊溶液通过70微米细胞滤器过滤，收集至冰上预冷的50 mL离心管中含20 mL 1×PBS缓冲液的溶液中。然后通过轻轻颠倒离心管20次以混匀溶液。

接下来离心该溶液。然后在组织培养罩内吸除上清液，并用30 mL冷洗涤培养基洗涤沉淀。

再次通过离心收集细胞沉淀。弃去上清液，并将沉淀重悬于25 mL培养基中。计数细胞，并将其接种至所需的培养板中。

根据实验设计，接种后，分离的原代肝细胞在1小时后已牢固贴壁，并在12小时后完全伸展。与全肝组织相比，分离肝细胞中肝细胞标志物（如转甲状腺素蛋白、CD95、ASGR1和ASGR2）的mRNA水平显著升高。

相比之下，免疫细胞、星状细胞和内皮细胞的存在较少。这由 CD45、胶原蛋白 I 型 α1 和内皮细胞 2 激酶 2 的 mRNA 水平显著降低所证实，表明该方案可大幅减少其他肝细胞的干扰。

接种后，ASGR1 和 ASGR2 的水平随时间下降，但在 12 小时时间点之前仍与全肝水平相当，尤其是 ASGR1。膜结合型 CD81 的表达水平在 48 小时内保持稳定。

相比之下，Toll样受体4的表达量总体增加，并在48小时后超过体内水平。胰岛素敏感性检测表明，胰岛素可显著促进肝细胞中丝氨酸473位点的AKT以及丝氨酸256位点的叉头框蛋白01的磷酸化。

表明原代肝细胞对胰岛素具有敏感性。经胰高血糖素处理后，磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶蛋白水平显著升高，提示葡萄糖生成途径被激活。

这种激活作用进一步通过葡萄糖生成增加得到证实，并且在与其他葡萄糖生成刺激剂（如Forskolin+IBMX）联用时，该方案可为使用小鼠原代肝细胞的研究节省时间和精力。

按照本方案，可开展相关的实验，例如假想的葡萄糖代谢和药物生物标志物检测。