通过多参数灌注控制分离大鼠原代肝细胞

本大鼠肝细胞分离方案基于消化前肝脏切除的方法。该方案介绍了一种紧凑且便携的一体化灌注系统用于细胞分离。该技术采用胶原酶循环利用，减少了胶原酶的使用量，同时在确保高重力沉降得率和肝细胞特异性功能的前提下，提供了更灵活的消化时间延长空间。

将大鼠放入通风橱中。剪开腹肌后，用弯头镊子的背面将肠道向右侧推移。用弯头镊子的尖端刺破胆管下方的膜，以便将缝线环绕门静脉和胆管。

使用丝线外科缝合线在门静脉接近肝脏处（即门静脉即将分支进入左右不同肝叶的位置）做一条非常松的结扎线。在第一条结扎线上游约2至3厘米处，即胃静脉即将从门静脉分出的位置，用两把弯头镊子的尖端在门静脉下方的组织上穿出一个小孔。随后将小孔扩大，以便在插管过程中支撑门静脉。

通过将泵速降低至每分钟四转，使流速约为每分钟三毫升，以防止肝脏内压力积聚。同时确保静脉导管流出的无钙缓冲液减少至缓慢滴注状态。用镊子轻轻支撑门静脉，同时持住静脉导管，使针头斜面朝上。

以10至20度的角度将针插入门静脉，然后缓慢推进，直至整个针尖斜面进入静脉内。正确插入后，肝脏颜色应出现变浅。

将套管沿针头推进，同时用食指向后拉动翼片，在拇指和中指固定导管的情况下将针头回撤至套管内。使用血管夹将门静脉固定在导管上，并在门静脉下方再夹闭一处，以避免灌注过程中血流中断。接着，剪断肝下腔静脉以防止肝脏内压力积聚，并观察是否有血液喷涌脉冲，以确认切割位置正确。

将泵速增加至38 RPM，以实现约33毫升/分钟的流速。用镊子夹闭肝下腔静脉2至3秒，然后重新打开，重复此操作三次，以冲洗肝脏。为了灌注所有肝叶，需调整导管尖端的位置，并确保其位于门静脉分支进入各个肝叶之前的部位。

然后，在门静脉分支点稍上游处收紧门静脉周围的松紧结扎线，并在硬针支撑导管处（斜面与侧孔之间）打三个结，固定导管在门静脉中的位置，以防止缓冲液反流。肝脏切除后，用无钙缓冲液灌注肝脏12分钟。随后，夹紧无钙缓冲液的滚压夹，松开胶原酶缓冲液的滚压夹，更换灌注缓冲液。

当胶原酶缓冲液到达肝脏后，关闭肝上腔静脉2到3秒，然后重新打开，重复此操作三次以冲洗肝脏。用镊子夹住膈肌并支撑导管，小心地将肝脏移至烧杯上方的平台上，以便胶原酶缓冲液循环。注意不要牵拉导管，以防意外脱落。消化肝脏12分钟，当肝脏失去光滑的棕褐色外观并变得松软时，停止灌注。

如有必要，可延长消化时间。肝脏消化完成后，小心切断门静脉并移除插管，然后将肝脏转移至冷的 DMEM 中以分离肝细胞。

使用弯头镊子的背面轻轻敲击肝脏，以破碎并剥离光泽的包膜。通过在DMEM中轻轻摇动肝脏，使肝细胞释放，直至细胞完全分散于培养基中。通过台盼蓝染色计数法测定，肝细胞的活力介于88%至94.8%之间。

从体重为200至300克的大鼠中分离得到的肝细胞产量可达每次分离5×10⁸个细胞。图中所示为未纯化的肝细胞悬液和纯化后的肝细胞悬液的代表性图像。通过计数白蛋白阳性荧光染色细胞占细胞核总数的比例，测定分离肝细胞的纯度约为96.8%。

在所示的假彩色图像中，绿色代表白蛋白，蓝色表示含有白蛋白的细胞核。不含白蛋白的细胞核以红色突出显示。采用三明治培养的肝细胞形成了清晰的胆小管结构，并具有良好的细胞间接触。

如白蛋白、尿素和细胞色素P450检测所示，肝细胞表现出高水平的尿素和白蛋白分泌。在第3天，肝细胞表现出较高的CYP1A2、CYP2B1/2和CYP3A2酶活性。在将针头插入门静脉之前，请做好心理准备。

插入后，外科医生需在切断下腔静脉后、泵速提高前持续操作而无脉搏。