透明化大脑中星形胶质细胞与神经元空间相互作用的研究

2013年首次描述的透明化技术是一种组织透明化技术，可实现对厚脑切片中大量细胞、血管乃至蛋白质进行单细胞分辨率的取样。该技术通过使整个脑组织透明，从而实现对完整微观结构的研究。本方案提供了一种简单芯片和直接的组织透明化操作流程。

该技术除可用于脑组织透明化外，还可用于其他系统的组织透明化。首先，用封口膜密封管子和管盖，并在管盖上打两个孔。然后，使用一端连接有内径为5毫米、19号针头的软管，将氮气从气罐中导入。

开始脱气：将管道连接到试管上，在室温下进行气体交换30分钟。断开管道连接，并立即用橡皮泥密封孔洞。然后将已密封的脱气试管转移至37°C水浴中，孵育3.5小时，使水凝胶溶液聚合。

将脑组织从管中取出。使用实验室擦拭纸，清除脑组织周围的聚合水凝胶，确保脑表面无残留凝胶。将脑组织切成较厚的切片，确保包含所有感兴趣的区域。

将切片放入第一种透明化溶液中，在37摄氏度、70转/分钟旋转条件下孵育24小时。在此期间，准备一个带孔的离心管用于放置脑组织，将该离心管放入盛有第二种透明化溶液的烧杯中，并置于搅拌装置上。

然后将脑组织放入烧杯中，并用铝箔密封，以防止褪色。待组织变为透明后，将脑组织转移至PBST中，在37°C下以70转/分钟的速度旋转孵育24小时。更换新鲜的PBST溶液，继续孵育24小时。

然后将脑组织转移至室温的磷酸盐缓冲液（PBS）中，孵育24小时。24小时后，将脑组织从PBS中取出，并转移至折射率匹配溶液中。在37摄氏度下避光孵育过夜。

首先，将样本放置在载玻片中央。使用热熔胶在载玻片边缘构建围壁，高度接近组织样本，但需确保其中一个角落留有小缝隙。

当热熔胶层接近脑切片高度时，在样品上滴加一至两滴折射率匹配溶液，以润湿上表面并防止气泡产生。在热熔胶仍处于液态时，用盖玻片密封顶部，尽可能均匀地放置盖玻片，然后用折射率匹配溶液充满腔室。最后用热熔胶封闭缝隙。

如果热熔胶壁超出载玻片的边界，则剪去延伸的部分。如果使用油浸物镜进行成像，需在盖玻片上方的胶壁再添加两到三毫米的胶，以保留浸油溶液。完成本方案后，脑组织将被透明化。

采用本方案制备透明化脑切片，以观察小鼠海马CA1区的星形胶质细胞和神经元群体。所有星形胶质细胞均表达tdTomato，兴奋性神经元则在其细胞核中表达H2B-GFP。为透明化组织制备的成像腔室适用于双光子或共聚焦显微镜下的成像。

利用双光子显微镜，观察了小鼠海马体CA1区透明组织切片中超过300个星形胶质细胞。红色显示海马体星形胶质细胞，绿色显示锥体细胞胞体，组织厚实且透明，呈现出这两类细胞之间的空间邻近关系。利用扫描激光共聚焦显微镜，追踪了兴奋性神经元的轴突束穿过整个半脑的过程。

绿色束状结构从背侧海马体向丘脑上体延伸。红色束状结构从乳头体向其起始处的腹侧海马体延伸。温度、浓度和孵育时间等因素影响了透明化处理的结果。

因此，该方案每一步操作的精确性对于获得清晰组织至关重要。利用此技术，我们测量了多种脑结构中神经元与星形胶质细胞之间的距离。该方案使得可分析的细胞数量比以往研究多出两个到三个数量级。