利用微流控共培养装置分析发育中牙胚的神经支配

本实验的总体目标是展示如何分离并共培养发育中的三叉神经节和牙胚。首先对微流控装置进行灭菌、安装和包被，以完成第一步。第二步是从目标小鼠特定发育阶段中解剖出三叉神经节和牙胚。

接下来，将三叉神经节和牙胚放入微流控装置中进行共培养。最后一步是固定细胞，并使用免疫荧光染色。最终通过显微镜观察共培养所形成的神经支配模式。

与现有方法（如传统共培养）相比，该技术的主要优势在于，它允许不同器官和组织在各自最适宜的培养基中进行共培养。该方法有助于回答人工成釉细胞领域中的关键科学问题，例如不同分子在成釉细胞形成过程中的作用，以及成釉细胞发育过程中的成釉规律。首先对解剖工具进行高压灭菌，包括一对显微解剖镊子和一把剪刀。

接下来，将一批尺寸为24毫米×24毫米的玻璃盖玻片放入1摩尔盐酸溶液中，在37摄氏度下置于旋转摇床中处理24小时，以进行灭菌。然后用无菌蒸馏水清洗盖玻片三次，再用99%乙醇冲洗三次，在无菌通风橱中干燥后，打开通风橱的紫外灯照射30分钟。随后将盖玻片保存在70%乙醇中，直至需要时使用。

接下来，使用无菌镊子小心地将轴突分离微流控装置从包装中取出，并用无菌的1毫米活检打孔器将其放入无菌培养皿中。每个样品在装置上对应培养腔的位置打一个孔。

注意打孔时不要离微沟槽太近，以免压力损坏微沟槽。接下来，将装置浸入70%乙醇中进行灭菌，并注意彻底去除所有滞留的气泡。

然后将器械从乙醇中取出，在无菌通风橱中彻底干燥。同时，将盖玻片从70%乙醇溶液中取出，并在无菌通风橱中晾干。至少等待三小时后方可继续后续操作。

将每张盖玻片放入六孔板的孔中。然后将微流控装置放置在盖玻片上，用镊子轻轻但牢固地按压，以确保分离装置与玻璃盖玻片之间完全贴合。接下来，用移液器向每个培养腔中加入150 µL浓度为0.1 mg/mL的多聚D-赖氨酸（poly D-lysine）。

然后将微流控装置置于真空环境中五分钟，以去除腔室内的所有空气。如果腔室内仍可见气泡，则将聚-D-赖氨酸溶液重新加入腔室中。

次日，将装置在37摄氏度下用多聚赖氨酸孵育过夜。用无菌蒸馏水洗涤腔室三次，然后向腔室中加入150微升浓度为每毫升5微克的层粘连蛋白工作液，在37摄氏度下孵育过夜。接着，按照随附的文字方案所述，准备三叉神经节和牙胚培养所需的培养基。

用70%乙醇清洁解剖区域和体视显微镜，并在处死动物后放置好解剖器械。对妊娠期为E14.5至E17.5的小鼠，解剖其下腹部周围的皮肤。然后使用剪刀小心地打开腹腔。

找到子宫，将其取出并放入装有冰块的离心管中。用冰冷的PBS解剖出胚胎，并将每个胚胎单独放入一个新的、盛有冰冻PBS的培养皿中。待所有胚胎从胚外组织中分离后，用剪刀将其头部剪除。

使用显微解剖剪小心地将下颌与头部其余部分分离，注意不要损伤三叉神经节。接着，将头部置于预冷的玻璃培养皿中，用镊子去除皮肤和颅骨。

然后将镊子置于头节下方并提起。为去除头节和小脑，需定位三叉神经节，并使用镊子和解剖针将三叉神经节与三叉神经分离，清理神经节。用解剖针作为刀具，将神经节保存在冷的PBS中。

去除舌体及下颌周围的皮肤。沿下颌中线切开，分离左侧和右侧半下颌。随后定位牙胚，并在解剖三叉神经节和牙胚后，用解剖针分离牙胚。接着从微流控装置中去除层粘连蛋白，并向腔室中加入200 µL相应的培养基。

用镊子将解剖好的三叉神经节和牙胚轻轻转移至用活检打孔器制备的孔中。确保牙胚不会漂浮，并沉降至与盖玻片接触。将样品置于37°C、5% CO₂的培养箱中进行培养。

每48小时更换一次培养基，持续10天。首先，将移液枪头指向孔板外侧，吸出旧培养基。然后在培养期间，将新鲜的预温培养基加到与培养小室相对的一侧孔中。

在任何时间点均可使用光学显微镜对共培养物进行成像。培养期结束后，通过移液向每个腔室的一个孔中加入 150 µL PBS，并让 PBS 流经腔室以清洗。最后一次清洗后，共重复洗涤三次。

吸除 PBS，每室加入 150 微升含 4% 多聚甲醛的 PBS 溶液，使液体流经另一室，对样品进行固定。室温孵育 15 分钟。随后用 PBS 洗涤两遍，继续进行后续分析，如出芽组织的免疫荧光染色与成像。

在共培养过程中，三叉神经节的神经突从其培养区分支延伸，朝向发育中的牙胚生长。在更高倍镜下，可以观察到神经突通过微流控装置中的轴突通道和微沟槽延伸。可通过随时间推移观察神经生长的进展，以描述其创新性发育过程。

完成此操作后，可进一步采用其他方法，如RNA分析或蛋白质化分析，以研究例如靶组织在干预后基因表达或蛋白质分泌的变化。