使用微流控装置生成神经肌肉接头

从一个带有聚合物涂层的微流控装置开始，该装置具有相互连接的微孔，内含彼此相对的镜像腔室，且腔室之间相互连通 通过 微沟槽

将种子神经前体细胞接种到一个区室的孔中。

让它们迁移进入相互连接的通道并黏附到聚合物上。

加入生长培养基，以促进神经元成熟为运动神经元。

在相对的隔室中，将肌源性前体细胞接种到孔中，这些细胞会迁移并黏附至相互连接的通道上。

用分化培养基替换原有培养基，诱导肌前体细胞融合，形成多核肌细胞。

向含有肌细胞的区室中加入含有生长因子的神经元分化培养基。

同时，向含有神经细胞的区域加入一半体积的无生长因子培养基。

对侧隔室中的生长因子以及更大体积的培养基促进运动神经元通过微通道延伸其突起。

这些神经元突起随后与肌细胞连接，形成神经肌肉接头。

为了在微流控装置中接种神经前体细胞（NPCs），使用200微升移液器从装置中微沟道一侧的两个孔中移除DPBS。每台装置在右上孔中加入60至100微升第10天的运动神经元培养基，共接种250,000个NPCs；将一半细胞悬液以45度角靠近通道开口处接种。

暂停数秒，使细胞悬液流经通道，然后将下层小室中剩余的一半细胞悬液加入。用记号笔标记接种了NPC或相应细胞的一侧，以便在无显微镜条件下轻松识别装置方向，并在孵育箱中孵育5分钟以促进细胞贴壁。接着，缓慢向两个接种了NPC的孔中补充额外的第10天运动神经元培养基，使每孔总体积达到200 µL。使用200 µL移液枪，移除微沟道另一侧、与新接种NPC相对的两个孔中的DPBS。

向未接种细胞的孔中每孔加入 200 微升第 10 天运动神经元培养基。然后，每个 10 厘米培养皿中加入 6 毫升 DPBS，置于装置周围，以防止孵育过程中培养基蒸发。

更换培养基时，将200微升移液器吸头置于与通道开口相对的孔壁底边，缓慢吸出含神经前体细胞（NPCs）的两个孔中的培养基。为防止培养基流动过强而损伤通道内的细胞，通过持续交替向顶部和底部孔中缓慢加入50至100微升新鲜运动神经元培养基。重复此操作，直至每个孔中含有200微升培养基为止。

在运动神经元分化的第17天，使用200微升移液器移除装置微沟道未接种侧的运动神经元培养基，并用DPBS洗涤各孔。每台装置以60至100微升生长培养基共接种200,000个人类原代中血管祖细胞（mesoangioblasts）或MABs，将一半细胞悬液接种于上方孔中。

暂停数秒，使细胞悬液流经通道，然后将剩余一半的细胞悬液接种到底部孔中，操作方式与之前接种NPCs的方法相同。将装置孵育5分钟，以使细胞贴壁。随后，向两个新接种MAB的孔中补充额外的生长培养基，并按照前述方法再次孵育。

在运动神经元分化第21天，向肌管区室每孔加入200微升含有生长因子的运动神经元基础培养基，以启动趋化性和体积梯度。然后，向运动神经元区室每孔加入100微升不含生长因子的运动神经元基础培养基。