使用小鼠骨骼肌微量组织分离线粒体进行高通量微孔板呼吸测定

以下实验的总体目标是利用基于微孔板的耗氧量检测技术，评估电子传递链、三羧酸循环、β-氧化途径以及底物转运蛋白的功能。该目标的实现首先需要配制检测所需的底物和注射溶液；第二步是将注射溶液加入预先水化的三合一检测试剂盒中，以校准耗氧量检测仪器。

接下来，配制线粒体底物溶液，并将这些溶液加入细胞培养板中。将细胞培养板离心，使线粒体贴附于孔板底部，然后将板放入呼吸代谢分析仪中进行检测。仪器将获得结果，显示基于每种呼吸代谢分析中线粒体呼吸作用的耗氧速率。

与现有的克拉克电极法等技术相比，该方法的主要优势在于基于微孔板的技术能够以更少量的线粒体实现更高效、更高通量的耗氧量检测。初学者通常会因实验准备过程中涉及的多个步骤而感到困难。实验前一晚，将三合一测定试剂盒置于1 mL校准液中，在37°C、无CO2的培养箱中水化过夜。次日，取出所有冷冻的组织样本，在37°C水浴或培养箱中解冻。配制所有底物溶液和注射溶液，并将其置于冰上保存。下一步是将多孔板式耗氧量检测仪设置为合适的混合、等待和检测参数。

进入分析软件并选择标准模式。进入Seahorse用户论坛，点击检测向导。进入检测向导后，点击方案以修改混合重量和测量参数。

在“背景校正”选项卡下标记背景孔，并确保进行高亮。执行背景校正。通过先点击“分组与标签”选项卡，再点击“分组信息”选项卡，来标记各实验条件。

输入这些参数后，单击“结束”，然后单击“保存模板”。开始此操作前，将注射溶液加载到检测运行盒中。注意将溶液注入正确的端口。

将检测运行卡盒的带缺口一角朝左下方向装入仪器中。首先进入分析软件，然后进入标准模式，启动校准程序。进入Seahorse用户论坛。

在 XF 驱动器的“模板”选项卡下打开已保存的模板。打开后，单击“开始”以启动校准，校准过程大约需要 30 分钟。本实验所用的线粒体分离自红色骨骼肌，将线粒体底物储备液轻轻但充分地混合，使用末端约剪去三毫米的 200 微升移液器吸头，通过反复吹打溶液进行混匀。

在测定线粒体储备液的蛋白浓度后，将每200微升琥珀酸盐已知底物混合液中加入10微克线粒体蛋白进行重悬。使用剪去末端约3毫米的200微升移液枪头，轻轻搅拌溶液，温和而充分地混匀线粒体-底物溶液。对于其余每种底物混合液，按每200微升含14微克线粒体蛋白的比例制备线粒体-底物混合液，并将所有线粒体-蛋白-底物混合液置于冰上。

将24孔细胞培养板置于冰上，并在每个孔中分别加入50微升线粒体底物混合液，每组设三个复孔。基于微孔板的三联检测法开发者建议至少设置两个不含线粒体的空白孔，最好位于细胞培养板的两侧。将细胞培养板在4°C条件下以2000 × g离心20分钟，使线粒体在离心过程中贴附于孔壁。

将底物溶液置于37摄氏度水浴中预热。离心结束后，小心地将每种底物溶液各450微升加入对应孔的上方。务必在室温条件下进行板的加样。

在空白孔中加入500微升底物空白液。用于电子传递检测的孔应加入电子传递底物，而偶联检测的空白孔可加入任意偶联检测底物。每孔加入450微升底物后，在20倍放大下观察孔中线粒体层，以确保线粒体均匀分散成单层。

如本示例所示，在氧消耗检测完成后，可剔除那些未形成均匀单层细胞的成像孔。确认线粒体已结合后，将细胞培养板转移至细胞能量代谢分析仪中。点击“确定”。

仪器将弹出此前用于校准的工具板。取下工具板，并将含有线粒体的细胞培养板放置于托盘上。细胞培养板上的蓝色缺口应置于托盘的左下角。

单击继续以开始检测运行，过程大约需要40分钟。运行完成后，按屏幕上的弹出按钮将细胞培养板弹出。培养板弹出后，取出并丢弃细胞培养板和 cartridge。

在屏幕上点击“继续”。运行结果将自动保存为数据文件夹中的 XLS 文件。打开此文件，通过点击 Y 轴标记下方的向下箭头，将显示从 O2 更改为 OCR。

接下来，在显示为选项的速率数据下，将中点更改为点对点速率。单击“确定”。为应用这些更改，请单击屏幕左下角的“孔板分组模式”标签，将条件相似的孔板分组在一起。

最后，单击屏幕左侧中间位置的“样本均值标准误”标签。这些命令也可以在测定开始前进行设置。这些曲线代表了四次偶联测定实验中随时间变化的氧气消耗速率（OCR）。

第一个图示代表状态二，即基础呼吸或不存在解偶联剂（DP）时的呼吸。在加入解偶联剂（DP）后的第二个图示代表最大偶联呼吸，也称为状态三呼吸。在加入寡霉素（oligomycin）后的第三个图示代表由质子漏引起的呼吸，也称为状态四呼吸。

加入FCCP后的第四组图像代表最大解偶联呼吸，也称为状态三U呼吸。加入抗霉素A后的第五组图像代表氧化呼吸的抑制。由于线粒体储备液与线粒体底物混合液充分混匀，且在黏附离心后形成了单层线粒体，所有线粒体状态的实验数据均具有最小的标准差。

相比之下，在每个孔中加入不等量的线粒体，且未形成单层线粒体层时，会导致各状态下的标准差增大，如蓝色轨迹所示：其每分钟氧耗率（OCR）值高于 1,500 ole，且在测量过程中呼吸速率逐渐下降，表现为逐点速率值的降低。需要注意的是，红色轨迹显示了稳定的逐点速率，且最大 OCR 值低于 1,500 ole 每分钟。线粒体蛋白过载还可能导致孔内微室中的氧气耗尽，从而影响后续每次测量中 OCR 的准确读数，如蓝色轨迹所示：在测量期间氧气（O₂）值接近零，且每次连续测量后的初始 O₂ 值显著降低。

在进行该实验操作时，务必注意在混合线粒体与底物溶液的过程中保持耐心。一旦掌握了这些方法，便可进一步拓展实验设计，以回答更多科学问题，例如：针对特定底物转运蛋白的药物治疗如何影响线粒体的氧气消耗？