通过高分辨率呼吸测定法测量人和小鼠骨骼肌纤维的线粒体呼吸

我们的研究聚焦于代谢疾病中代谢与应激反应的交汇点，这也是华盛顿大学NORC项目的一个重要主题。通过NORC各核心单元之间的协同作用，我们能够以跨学科和协作的方式，解决营养代谢与疾病中的复杂问题。传统的线粒体呼吸测定方法研究的是分离的线粒体。

分离线粒体耗时较长，且可能破坏线粒体外膜的完整性。此外，线粒体并非独立发挥作用，而是细胞代谢动态网络的一部分。我们的实验方案保留了这一网络结构，从而能够对线粒体功能进行符合生理状态的相关评估。

我们的研究重点已扩展到识别在健康与疾病中对代谢修饰起重要调控作用的调节因子。我们正在探讨的关键科学问题包括：这些调节因子（例如位点-1蛋白酶）在不同组织类型中是否具有同等重要性？以及，它们的生理学意义是什么？

首先，开启高分辨率呼吸测定仪和真空系统。取下塞子，然后使用真空系统除去70%乙醇保存液。

用超纯分子级水重新填充腔室。最后一次洗涤后，向每个腔室中加入 2 毫升不含肌酸和blebbistatin的MiRO5。打开呼吸测量软件。

在弹出窗口中，将反应室搅拌速度设为 750 RPM，温度设为 37 摄氏度，数据记录间隔设为 2 秒。将氧传感器的增益设为 1，极化电压设为 800 毫伏。单击“连接至氧图仪”以建立与仪器的通信。

在弹出的对话框中，使用当前数据和校准信息命名并保存实验文件。至少记录 30 分钟的氧浓度，以使检测室充分预热，并记录用于空气校准的信号。校准结束时，按住 Shift 键和鼠标左键，在时间轴上拖动以标记一段稳定的氧浓度区域。

进入氧图界面，然后进行氧气校准。进行空气校准后，选择稳定的氧气浓度标记，点击“校准”并复制到剪贴板。停止空气校准记录，并保存文件。

校准呼吸测量系统后，将每个腔室中的 MiRO5 替换为 2.1 毫升新鲜的 MiRO5 溶液。在呼吸测量软件中输入仪器设置，设定文件名并保存设置。

在下一个对话框中，输入样品信息，包括添加到每个腔室的每份样品的重量。现在，打开氧气校准窗口。点击“从文件复制”并选择已保存的空气校准文件。

然后，点击“校准并复制到剪贴板”按钮。使用精细镊子，小心地将先前从小鼠分离的肌纤维束转移至呼吸溶液中。将塞子盖在腔室上，并将其向下推至约一半位置，以使腔室处于半封闭状态。

当塞子上的 O 型圈与腔室壁接触后，一边向下按压一边旋转以关闭腔室。当腔室关闭至一半时，可在腔室顶部观察到一个小气泡。用 10 毫升塑料注射器从氧气瓶中抽取纯氧气。

将长而钝的针头安装到注射器上，然后将针头插入第一个腔室，缓慢注入约1毫升氧气。监测腔室中的氧气浓度。当浓度达到每毫升350至400纳摩尔时，轻轻旋转塞子同时向下按压，以完全封闭腔室。

观察反应室，确保无残留气泡。为将氧通量数据归一化至组织质量，请从布局菜单中选择“每单位样品特异性通量”布局6。在加入氧气后，需待氧浓度和氧通量稳定，方可开始呼吸作用测量。

使用10微升玻璃注射器，向每个腔室加入2.5微升0.8摩尔的苹果酸。按下F4键标记时间线，并将标记标注为M。记录一到两分钟稳定的氧气通量。进行有氧糖酵解实验时，向每个腔室加入10微升2摩尔的谷氨酸和5微升2摩尔的丙酮酸。

按下 F4 键标记时间线，并用 GP 标注该标记。每间室中加入 10 µL 的 2 M 谷氨酸和 10 µL 的 10 mM 棕榈酰肉碱，作为脂肪酸底物。按下 F4 键标记时间线，并用 GPC 标注该标记。

记录一到两分钟的稳定氧通量。使用25微升玻璃注射器，向每个腔室加入20微升0.5摩尔的ADP。按下F4键标记时间线，并将标记标注为ADP。

记录一到两分钟稳定的氧通量。现在，向每个腔室加入20微升1摩尔的琥珀酸。按下F4键标记时间线，并将标记标注为S。记录一到两分钟稳定的氧通量。

使用10微升玻璃注射器，向每个腔室加入5微升4毫摩尔的细胞色素c。按下F4键标记时间线，并将标记标注为细胞色素c。记录一到两分钟稳定的氧通量。

使用10微升玻璃注射器，分三次加入1微升1毫摩尔的FCCP。加入FCCP后会导致氧通量水平短暂下降。待氧通量回升并稳定后，再进行记录。

按下 F4 键以标记时间线，并用 FCCP 标注该标记。记录一到两分钟稳定的氧通量。实验结束后，轻轻旋转并向上拔出密封塞以将其移除。

用超纯水冲洗腔室三次，随后用70%乙醇冲洗三次。将塞子放入腔室，直至感到阻力，但不要完全关闭。然后盖紧塞子。

保存检测文件并断开仪器与软件的连接。最后，关闭呼吸仪。在制备良好的镜像样品中，ADP 加入后添加细胞色素 c 不影响氧通量，证实线粒体外膜的完整性。

然而，当组织样本未被正确制备时，在加入ADP后添加细胞色素c会导致氧通量增加40%，表明线粒体外膜已受损。