精确局部转移细胞或DNA至早期着床后小鼠胚胎的方法

这些操作的总体目标是演示如何将细胞或 DNA 精确地转移到早期着床后的小鼠胚胎中。这些方法有助于回答发育生物学中的关键问题，例如测试体外培养细胞在体内的潜能，以及特定基因在胚胎发育特定阶段的功能。这些技术的主要优势在于无需任何专用设备，即可实现对早期着床后小鼠胚胎的实验操作。根据实验方案，在 E 7.5 或 E 8.5 天处死怀孕雌鼠后，使用剪刀和镊子分离子宫，并将其置于含有 M2 培养基的 30 毫米培养皿中，同时使用两对精细镊子进行操作。

小心地撕开子宫肌层，然后剥离蜕膜，注意不要刺破胚外腔。用镊子夹住瑞克氏膜并缓慢将其从胚胎上分离。接着在体视解剖显微镜下检查胚胎，确保卵黄囊、羊膜以及卵黄囊胎盘锥体结构完整。用移液器将胚胎转移至干净的M2培养皿中，再置于直径30毫米的塑料培养皿盖上，放在冰上或冰架上，使胚胎部分冷却。

根据文字方案准备培养基并培养胚胎，以将培养的细胞移植到小鼠胚胎中。首先使用200微升移液器吸头从表达GFP的六孔培养板中物理刮取囊胚干细胞，将细胞转移至含有胚胎的培养皿中。

将手工拉制的移植毛细管连接至吸管管端，制成口吸移液管，轻柔地用口吸法吸取一滴或多滴包含超过20个细胞的细胞团块进入移植毛细管。然后轻轻吹出细胞以分散较大的团块。选择一个包含约10至20个细胞的细胞团块，并将其吸入移植毛细管中。

再次用镊子将组织块保持在毛细管开口附近。轻轻固定胚胎，并将移植用毛细管插入目标区域，以形成开口。

轻柔地将细胞团从移植毛细管中推出，使一串10至20个细胞保留在胚胎内。将胚胎留在同一培养皿的M2培养基中，使用荧光体视显微镜和相机对移植后的胚胎进行成像。尽量缩短成像时间，以避免胚胎暴露于过量的光照和热量中。

使用琼脂糖凝胶成像后，立即将胚胎连同极少量的M2培养基转移至预先平衡的培养液中，并根据文本方案中的指南进行培养。在进行电穿孔实验前，使用水平显微拉针仪制备DNA注射针，使其具有精细的尖端，开口直径小于10微米，以避免组织损伤。对于玻璃毛细管电穿孔，使用显微烧制仪将DNA注射针的开口切割至内径为20或30微米，确保尖端光滑且无破损边缘。将每根铂电极连接至一根细的绝缘导线，并插入用绝缘胶带包裹的显微注射针固定器中。

制备手工毛细管电极时，将直径为0.2毫米的铂丝插入电穿孔玻璃毛细管中，毛细管末端固定开口直径为20或30微米。目的是聚焦电流，将质粒DNA递送至胚胎的特定小区域。制备L形电极时，将直径为0.2毫米的铂丝弯成L形，使L形的水平部分长度约为1毫米。

将持针器安装在标准的显微操作仪器支架上。将毛细管电极连接到电源的阳极。将L形电极连接到万用表的阳极。

然后将万用表的阴极连接到电源的阴极。用 PBS 缓冲液填充电穿孔玻璃毛细管，液面距管顶约一至两毫米，将直形铂电极插入玻璃毛细管中，直至到达毛细管底部。将 L 形电极固定在盛有 PBS 的 30 毫米培养皿表面。

使用气动皮升泵进行DNA注射。将注射针从胚胎的侧脑室插入羊膜腔内，向腔内注射约五微升DNA溶液，直至完全充满。注意不要刺破胚胎。

然后小心地将胚胎置于电极之间，并将毛细管电极移动至需要递送 DNA 的精确位置。使用 200 伏电压，施加六次电脉冲，每次持续 50 毫秒，脉冲之间间隔 1 秒。电穿孔后立即将胚胎转移至预先平衡的培养基中，随后对下一个胚胎重复电穿孔操作。

在电穿孔后两小时检测被电穿孔的活细胞或死细胞。根据此处所示的文字方案，为在 E 7.5 期移植了普遍表达 EGFP 的表皮 PSCs 的胚胎，并在体外培养 24 小时。当将 10 至 16 个 fscs 移植到 E 7.5 期胚胎中时，它们能够很好地整合并增殖于宿主胚胎内。

然而，移植更多的细胞并不会产生更好的嵌合率，反而会形成未整合的细胞团块，如本实验所示。如表达GFP的质粒电穿孔实验所示，电穿孔后一至两小时即可检测到GFP阳性细胞。

在原肠胚晚期阶段胚胎中，对远端上胚层细胞进行电穿孔后，经24小时培养，标记的细胞贡献于神经外胚层，这与已知的原肠胚阶段上胚层细胞的命运图谱相符。该结果表明，与使用其他类型电极进行电穿孔类似，毛细管电极也会在靶向区域引起一定程度的细胞死亡。由于该区域颜色较邻近区域更深，通过使用膜不通透的远红荧光染料标记死亡细胞的细胞核得以证实。

证实毛细管电穿孔技术仅在电穿孔位点附近导致少量细胞死亡。在进行这些操作时，重要的是在两小时内开始培养胚胎。在培养结束时从鼠类分离子宫后，可对胚胎进行固定。

还可以进行其他方法，如切片染色，以回答更多问题，例如供体细胞或电编织细胞对宿主胚胎的贡献。观看本视频后，我们应能充分理解如何将细胞或DNA精确地转移到早期着床后小鼠胚胎中。