使用多色荧光报告小鼠对角膜细胞进行谱系示踪的方法

本方法的总体目标是定位并追踪角膜上皮中干细胞和前体细胞的迁移、扩增及存活情况。该方法有助于解答角膜上皮细胞生物学领域中有关组织稳态、组织修复、衰老及病理学的关键问题。该技术的主要优势在于易于建立，并可实现以克隆方式对细胞进行无创性的谱系示踪。

首先，选择一种带有可诱导组织特异性启动子的Cree转基因小鼠品系，用于标记角膜缘和角膜上皮祖细胞及干细胞。本实验采用他莫昔芬可诱导的K14-CreERT品系。接下来，根据研究问题和可用的Cree品系，选择合适的脑bow（brainbow）表达盒。

本实验采用 Brainbow 2.1 品系。将纯合的 R26R-confetti 品系与纯合的 K14-CreERT 品系杂交，以获得可表达四种颜色的 K14 阳性细胞的小鼠。为在转基因小鼠中诱导重组，首先称取 80 毫克他莫昔芬，加入 1 毫升玉米油，通过涡旋振荡溶解。

将溶液置于摇动水浴中，在65摄氏度下维持至完全溶解，并保留在水浴中直至下次使用。对一只八周大的Brainbow 2.1 Cree ERT杂合小鼠，通过脚趾夹捏法仔细检查麻醉深度后，将100微升他莫昔芬溶液直接施加于小鼠的每侧眼球表面。他莫昔芬的直接应用可实现高效的Cree诱导。将任何剩余的他莫昔芬溶液避光保存于4摄氏度，最多可保存一周。

在应用前将溶液预热，每只小鼠连续三天重复此操作。首先将一克他莫昔芬粉末溶解于五毫升无菌二甲基亚砜中。为配制200毫克/毫升的溶液，将该溶液置于摇动水浴中，在65摄氏度下保持至溶液变澄清，并在使用前一直保留在水浴中。

然后对小鼠进行麻醉，并通过脚趾夹捏法检测麻醉深度，对小鼠未处理的眼睛涂抹眼膏以防止手术过程中角膜脱水，并给予充分的镇痛剂。接下来，用不带针头的注射器吸取200 µL他莫昔芬溶液，并将其均匀滴加于眼球的整个角膜表面。该液体在室温下接触组织后会固化。

持续观察小鼠，直至其保持胸卧位，并仅在其完全清醒后才将其放回其他小鼠中。在诱导后的适当时间点处死小鼠，按照文本方案所述进行眼部损伤操作。首先按压眼睑，使眼球从眼窝中突出，从而进行眼球摘除。

将弯镊子滑至眼球后方，夹住视神经并向上牵拉眼球以使其脱离。将每个眼球置于含有PBS的60毫米培养皿中。将盛有眼球的培养皿置于手术体视显微镜下。

确保识别出眼睛的基本结构，包括角膜、角膜缘和视神经。去除视神经、眼外肌及眼睛周围的结缔组织。用镊子夹住眼球后部，使角膜朝下，使用弹簧剪在眼球后部的巩膜上做切口。

扩大切口以便晶状体弹出，并用镊子移除虹膜。接着，从中心向周边做四到五个放射状切口，以压平角膜，然后用薄而扁的刮匙清除残留的虹膜组织。最后，修剪围绕角膜缘的多余周边组织，以固定角膜。

将解剖后的组织转移至12孔板中，加入4%多聚甲醛，4℃孵育10分钟。随后用PBS短暂洗涤组织，以染色细胞核。将角膜置于每毫升含2微克的DPI溶液中孵育10分钟，接着用PBS短暂洗涤。

接下来，将角膜放置在载玻片上，上皮面朝上。然后在角膜上滴加一滴封片介质，并盖上盖玻片。将载玻片在室温下干燥过夜，随后于4°C保存。

进行角膜成像时，使用光谱共焦系统，以分离 R-F-P-Y-F-P-G-F-P 和 CFP 的发射信号。首先根据脑组织中荧光蛋白的特性设定荧光、激发和发射波长。使用 Bo 型盒时，需注意避免激发光串扰或发射信号重叠。

接下来，获取拼接图像以高分辨率观察整个角膜。在此，于全部四个荧光通道中获取 12×12 的图像阵列。最后，合并图像以生成一幅复合的谱系图。

利用 R 26 R confetti 小鼠进行示踪实验，以追踪角膜缘和角膜上皮祖细胞的命运。在稳态条件下，诱导后 10 天可观察到少量荧光细胞簇，结果符合预期。四个月后，出现了从角膜缘延伸至角膜中央的条纹状结构，提示在角膜损伤后，细胞从角膜缘迁移以再生角膜。

从角膜缘出现的条带状迁移迅速发生，长而粗的角膜缘条带在七天内形成。该模型对于在不同条件下追踪和研究角膜干细胞及其前体细胞具有重要价值。它将有助于在稳态以及损伤、化学烧伤、突变等应激条件下，对克隆性细胞扩增、存活和迁移进行深入探究。

该模型还可用于解析正常和病理性角膜再生背后的分子机制。该技术可能有助于我们理解不同的病理状况，如角膜营养不良、烧伤和角膜外伤，并可用于评估不同治疗对角膜再生、细胞扩增和迁移的影响。