利用双色标记克隆分析系统进行细胞谱系追踪与基因功能研究

本双标记MARCM技术方案的总体目标是进行高分辨率的细胞谱系分析，并更深入地研究基因功能。脑组织包含大量不同类型的神经元，研究发育过程中神经元如何组装形成特定结构的机制具有挑战性。该技术的主要优势在于能够用两种不同的颜色标记源自同一神经前体细胞的神经元。

从而能够追溯单个神经元信息的产生过程。因此，该技术可帮助研究人员探索神经发育背后的细胞与分子机制。今天演示该实验操作的是 Pei-Chi Chung。

余教授实验室的技术员。首先将双标记MARCM准备好的雄性和雌性果蝇与含有新鲜酵母的果蝇培养基一同放入培养管中。将杂交的双标记MARCM准备好的果蝇在25摄氏度下维持两天，以提高交配几率，然后再收集受精卵。

为避免幼虫孵化后过于拥挤，轻敲已交配的双标记MARCM果蝇，转移至新加入酵母的培养管中。培养双标记MARCM后代，直至其发育至所需阶段。此处，将对处于幼虫阶段的果蝇进行热激处理，以诱导flippase的表达。

将果蝇小瓶分别转移至37摄氏度水浴中处理10、20、30、40和50分钟，以确定flippase表达的最佳热激条件，从而获得目标 twin-spot MARCM 克隆。热激的时间点决定清除事件发生所处的发育阶段，而热激持续时间则决定生成清除事件的数量。

将热激的双标记 MARCM 动物在 25 摄氏度下培养至所需发育阶段，然后进行染色和封片。向镊子保护皿中加入 PBS。

然后，将双标记 MARCM 动物转移至培养皿中。在体视显微镜下观察，用镊子从双标记 MARCM 动物中解剖出大脑。首先，将果蝇的头部从身体上分离。

然后轻轻去除表皮，注意不要损伤脑组织。接着，小心移除呈白色纤维状的气管。将脑组织转移至含有4%甲醛和PBS的玻璃斑点板中。

室温下固定20分钟。开始染色程序，用1% PBT冲洗果蝇大脑3次，然后用1% PBT洗涤3次。

每次轻摇30分钟。将果蝇脑组织与一抗混合液在4°C下孵育过夜，或在室温下孵育4小时。用1% PBT缓冲液冲洗并洗涤果蝇脑组织三次，每次均轻轻振荡，操作同前。

然后在室温下用二抗混合液孵育果蝇脑组织4小时，或在4°C下孵育过夜。按照之前的方法用缓冲液漂洗和洗涤脑组织后，将脑组织用抗淬灭试剂封片于显微载玻片上。随后盖上盖玻片，以覆盖并保护果蝇脑组织。

使用透明指甲油密封盖玻片和微型载玻片的边缘。最后，利用选定的共聚焦显微镜系统采集样品中双标记 MARCM 克隆的荧光图像。该图展示了双标记 MARCM 克隆的结果，即通过诱导 Flippase 产生的 VL2p 前背侧嗅觉投射神经元。

为了在胚胎阶段介导adPN神经母细胞中的有丝分裂重组。该示意图展示了神经发生模式。在此脑部的共聚焦显微镜图像中，VL2p adPNs以绿色显示，与品红色的多细胞神经母细胞adPNs相关联。

此图像显示了侧角中的细胞。此处可见触角叶的神经元形态。此图像展示了DL1 adPNs的数据。

如图所示，DL1 adPNs 在发育过程中出现的时间晚于 VL2p adPNs。通过诱导 DC3 adPNs 的双标记 MARCM 克隆可以证明，这类神经元在发育过程中出现较晚。该图像显示，在 adPN 细胞谱系中，双标记 MARCM 事件发生于一个 GAL4 阴性的神经元内。

一旦掌握，该技术可帮助研究人员分析神经谱系，并提供不同的标记物以区分神经元与神经母细胞克隆。此外，在杂合遗传背景下，双色标记 MARCM 技术还可产生纯合突变克隆，以探究分子机制。