植物角质层脂质聚酯单体的分离与组成分析

维管植物依赖于细胞外层，这些结构在植物组织与外部环境之间起到防水屏障的作用。这些亲脂性细胞及其相关结构可限制病原体侵染，并调控气体、水分及溶解物质在植物组织内外的被动运输。其中一种重要的屏障是植物角质层，这是一种植物特有的复杂结构。

角质是一种不溶于水的甘油脂类聚酯，构成角质层的结构基质，并与可溶于溶剂的蜡质相关联。本文介绍一种可靠的分析脂类聚酯组成及去除植物组织中脂质的方法。在本方案中，采集完整的组织样品，进行均质化处理，并通过一系列溶剂萃取彻底去除可溶于溶剂的脂质，包括角质层和表皮蜡质。

膜脂中的甘油三酯。随后，样品在甲醇钠催化的甲醇解作用下解聚为其组成的脂质单体。加入模拟试剂，将羟基转甲基化为其相应的三甲基硅烷衍生物，以适用于气相色谱分析。

随后将衍生化残余物转移至气相色谱小瓶中，并装入气相色谱-质谱联用仪（A-G-C-M-S）进行分析，生成色谱图，以表征生物聚酯的单体组成。这些成分存在于提取的样品中。本实验中，我们采集了野生型及两种突变型成熟拟南芥（arabidopsis ANA）植株的完整叶片样品。

进行提取和分析时，将0.5克组织加入已用氯仿预冲洗过的洁净玻璃试管中。在烧瓶中加入100毫升异丙醇，并添加丁基化羟基甲苯至终浓度为0.01%。BHT是一种抗氧化剂，用于在溶剂提取过程中保护双键和脂肪酸免受氧化。将溶剂在水浴中预热至约85摄氏度。

每克植物组织加入 25 毫升加热的异丙醇，将样品置于 85 摄氏度的加热金属浴中孵育 15 分钟。让离心管冷却至室温，并佩戴耳部和眼部防护装备。最后，使用匀浆器研磨样品以获得均匀分散，用螺旋盖密封离心管，并在 100 转/分钟的条件下振荡 1 至 2 分钟，然后在 800 ×g 条件下离心 10 分钟。

为了将有机相与沉降到沉淀中的高密度物质分离，使用巴斯德吸管或移液器吸除并弃去上清液。注意避免扰动沉淀。加入等体积的室温异丙醇，并将样品在过夜时间内振荡。

在100 RPM条件下离心样品，并弃去上清液。每克组织加入25毫升氯仿与甲醇按2:1配制的溶液，混匀后过夜震荡，随后离心并弃去有机相。然后使用氯仿与甲醇按1:2配制的溶液重复此步骤。

将沉淀物在室温下干燥过夜，然后将离心管从通风橱转移至含有无水硫酸钙的真空干燥器中，继续脱水至少三天，或直至样品质量恒定。待样品完全干燥后，即可进行甲醇钠催化的甲醇解去酯化反应。使用玻璃注射器向含有干燥组织的离心管中加入两种内标溶液，依次加入25 µL的甲基二十烷酸酯（methyl HETO decanoate）和25 µL的ω-戊内酯（omega pentec and lactone）。

为启动深度聚合反应，向样品中加入 0.9 毫升乙酸甲酯，随后加入 1.5 毫升甲醇钠催化剂和 3.6 毫升甲醇。在反应体系中，将样品于 60 摄氏度孵育两小时，并定期涡旋混匀；在此过程中，脂质聚酯与亲核性甲氧基阴离子反应，形成不稳定的四面体中间体，该中间体迅速解离为脂肪酸甲酯和甲氧基阴离子。这些甲氧基阴离子作为共轭碱，与甲醇反应重新生成具有催化活性的甲氧基阴离子，从而维持并促进进一步的深度聚合反应。

如果系统中存在水，它会与甲醇钠反应生成氢氧化钠。氢氧化钠是一种强碱，可将聚酯不可逆地转化为不期望的游离脂肪酸。为了防止水解，加入乙酸甲酯以去除系统中任何存在的氢氧化钠，而不是使用脂肪酸。

让离心管冷却至室温。孵育结束后，向每根离心管中加入10毫升二氯甲烷以萃取单体。然后加入1.5毫升冰醋酸以酸化样品。

用 0.5 摩尔氯化钠溶液填充试管，充分涡旋混匀，并离心数分钟。在通风橱内操作。用移液器小心将下层有机相转移至洁净且预先用溶剂冲洗过的中等大小试管中。

用生理盐水再次洗涤样品，涡旋混匀后离心10分钟。弃去上层水相，然后向样品中加入无水硫酸钠作为干燥剂，以去除溶液中残留的微量水分，涡旋混匀样品后离心，将溶剂转移至洁净且预先用溶剂润洗过的小型离心管中，将离心管放入氮吹仪中蒸发溶剂，得到单体的干燥残留物。使用玻璃注射器加入100 µL嘌呤和100 µL B-S-T-F-A，将羟基转化为易挥发的三甲基硅烷衍生物。

将样品在100摄氏度下孵育10分钟。让离心管冷却并在氮气下挥发。加入500微升体积比为1:1的正庚烷-甲苯溶液以红色溶解残留物，然后短暂离心。

将衍生化样品转移至含有400微升插件的GC小瓶中。将装有样品的小瓶放入气相色谱仪，仪器将样品注入毛细管柱进行分析，洗脱物随后由四极杆质谱检测器检测。通过GC-MS分析获得的原始数据经过处理后，以每份样品的色谱图形式呈现。

通过各自特定的质谱图鉴定对应于不同色谱峰的单体。利用气相色谱保留时间，采用内标法对各单体含量进行定量，从而实现样品间单体丰度与组成的比较。图中显示的是从兔脓肿叶片组织中释放的单体的代表性分析结果的叠加色谱图，该组织对应于编码P450单加氧酶的基因的野生型及两种突变等位基因，显示出不同的单体谱型。

我们的结果表明，三种主要的角质单体在野生型和突变型拟南芥植株中的丰度存在显著差异。本实验方案是一种通过分离、鉴定和定量其组成单体来分析植物脂质聚酯成分的可靠方法。该方法具有可扩展性，可轻松适应大量不同植物材料的处理，包括根、种子、叶片及其他完整组织。

该技术适用于研究高等植物中角质和木栓质的生物合成调控及其分布。