基于胶体金的免疫层析试纸条的研制及其在鲸类肌红蛋白检测中的应用

本胶体金免疫层析试纸条的总体目标是区分鲸豚类动物与海豹及其他动物的肌红蛋白。该方法可对鲸豚类肉类进行快速、现场的筛查，从而遏制其非法贸易和消费。该技术的主要优势在于，仅需均质化0.3克肌肉组织，即可在5至10分钟内直接观察到结果，具有极高的特异性和灵敏度。

因此，该方法可实现对鲸豚类肉类的现场快速检测，也可应用于其他肉类，如马肉或猪肉。为设计用于制备针对鲸豚类肌红蛋白的单克隆抗体的合成肽，需分析多种动物肌红蛋白抗原反应区域的氨基酸序列。

首先从 GenBank 获取金枪鱼、鸡、鸵鸟、家养哺乳动物、海豹以及 18 种鲸类动物的肌红蛋白氨基酸序列。接着使用适当的软件对这些序列进行比对。通过在启动栏中选择“比对编辑/构建比对”来启动比对分析工具。

选择“创建新比对”，然后点击“确定”。此时将弹出一个对话框，询问您是要构建 DNA 还是蛋白质序列比对。点击标有“蛋白质”的按钮，选择“数据”→“打开”→“从文件中检索序列”，然后选择序列文件。使用“编辑”→“全选”菜单命令，以选中数据集中每条序列的所有位点，用于创建多序列比对。

从主菜单中选择“比对”→“使用ClustalW进行比对”。选择BLOSUM作为蛋白质权重矩阵，然后点击“确定”按钮。第三步是分析序列比对结果。

重点关注五个抗原反应位点，并找出在鲸类中保守的片段。星号表示序列比对中的共识，代表该位置具有单一且完全保守的残基。在鲸类中发现了两个保守片段。

随后合成候选序列片段，并用于制备单克隆抗体。首先确定胶体金溶液的最佳pH值，即在两小时内保持单克隆抗体与胶体金溶液混合物呈红色的最低pH值。将0.15微克纯化的检测用单克隆抗体分别加入pH值从5到9的100微升胶体金溶液中。

本演示实验中测试了 pH 6 和 pH 8 两种条件。通过该优化步骤确定 pH 8 为最佳 pH 值。接下来，在 pH 8 条件下，向 100 µL 胶体金溶液中加入不同量的纯化检测用单克隆抗体，以确定单克隆抗体的最佳浓度。

最佳浓度在此研究中为每毫升6微克，可使混合物保持红色，且无黑色沉淀产生。根据优化步骤的结果，将60微克纯化的检测用单克隆抗体逐滴加入10 mL胶体金溶液中。室温下轻轻乳化混合物10分钟。

加入2毫升含5% BSA的PBS溶液至混合物中，室温下轻轻乳化15分钟，以减少背景干扰。在4°C条件下，以10,000 × g离心30分钟。离心后，小心移除含有未结合抗体的上清液，并将所得沉淀物重悬于4 mL含1% BSA和0.1% Tween-20的PBS-T中。

重复离心和重悬步骤一至两次。将最终沉淀物重悬于1 mL PBS-T中，于4摄氏度保存备用。此处展示了免疫条带设计的示意图。

纸板、垫片和硝酸纤维素膜的尺寸详见实验方案文本。为延长储存寿命，免疫试纸条应在低湿度的实验环境条件下制备和组装。使用微量移液器将胶体金标记的单克隆抗体溶液加入结合垫，使其充分浸润，然后在 37 摄氏度下干燥一小时，再进行组装。

待结合垫干燥后，使用双面胶带先将硝酸纤维素膜贴在纸板上。使用免疫试纸条打印机，将特异性抗原捕获单克隆抗体和快速抗小鼠IgG分别点在硝酸纤维素膜的检测区和质控区。两个区域之间应保持大于五毫米的距离。

然后将结合垫贴在硝酸纤维素膜的一侧，将吸收垫贴在另一侧，两侧的垫子相互重叠约两毫米。将样品垫覆盖在结合垫上两毫米，并粘贴到纸板上。使用切纸器裁切成六毫米宽的条带。

将试纸条与干燥剂一同装入铝箔袋中，于4°C保存至使用。为进行交叉反应性测试，向0.03克生肌肉组织中加入1 mL含0.1% BSA的PBS溶液，并使用竹棒或研磨棒将样品均质化。

握住免疫试纸条远离检测区域的一端，将样品垫部分浸入样本中，持续5至10分钟。直接观察结果。每种肌肉样本均需进行三次重复检测。

T检测线的设计原理是当两种单克隆抗体均检测到鲸类肌红蛋白时，显示阳性信号。由于非鲸类动物的肌红蛋白只能被这两种单克隆抗体中的一种检测到，因此在检测其他动物的肌肉样本时，检测线显示阴性结果。C质控线应始终显示阳性结果，因为快速抗小鼠IgG会结合胶体金标记的检测抗体。

对照线出现失败结果，表明试纸条上材料的质量较差。利用杂交瘤上清液进行的西部印迹血液分析显示，CGF5H9单克隆抗体在约17kDa的预测分子量处检测到鲸类及其他哺乳动物，呈现为单一的染色条带。其中，普通小须鲸的条带相较于其他鲸类的条带较弱。

金枪鱼、海豹和鸡的样品中未出现条带，而猪在约50 kDa处可见条带。点样血液分析获得相同结果。

尽管使用 CSF1H13 单克隆抗体进行的西方血液分析在猪和金枪鱼中显示出多条非特异性条带，但 CSF1H13 具有高度特异性，因为它仅与鲸目动物发生反应。而海豹在预期分子量约为 17kDa 处出现一条条带。点状血液分析可获得相同的结果。

使用纯化的CGF5H9对不同物种的肌肉提取物进行间接ELISA检测，结果显示牛、山羊、狗、兔子和鲸目动物呈阳性信号，猪呈弱阳性信号，而金枪鱼、鸡和海豹呈阴性信号。CSF1H13对鲸目动物和海豹具有高亲和力。这两种单克隆抗体均可与来自不同科的四种鲸目动物物种强烈反应，表明它们对多种鲸目动物具有广泛的反应性。

免疫胶体金试纸的特异性通过这些代表性结果得以展示。使用非鲸目动物肌肉样本时，仅在控制线处出现一条条带；而当使用鲸目动物肌肉样本时，测试线和控制线处均出现信号条带。

一旦掌握，若操作得当，标记抗体的制备及试纸条的构建可在四小时内完成。进行该实验时，务必注意仔细设计肽段，并采用多种方法筛选合适的单克隆抗体。

使用高质量的胶体金制备标记抗体。按照这些步骤，还可进行其他方法，如基于PCR的DNA分析，以回答更多问题，例如鲸类物种及其来源地。CSF1H13单克隆抗体具有强效性，且仅对海洋哺乳动物具有亲和力，可用于多种ELISA形式，为研究海洋哺乳动物肌红蛋白的生物学、生理学和化学特性提供多种机会。

观看本视频后，您应能充分了解如何开发特异性单克隆抗体，并将其应用于快速检测试纸条。