基于适配体-金纳米粒子比色法检测技术的设计与开发及其在野外现场的应用

总体目标是提供一种基于适体-金纳米粒子比色法检测目标分子的通用开发方法，并提供提高长期储存稳定性和降低假阳性反应率的策略。该方法解决了金纳米粒子适体比色检测领域中的关键问题，例如检测方法在长期储存条件下的可重复性以及假阳性反应率的降低。这些检测方法容易出现保质期短和假阳性反应等问题。

在本研究中，我们对上述两个问题均进行了改进。在化学安全通风橱中，使用5毫升浓硝酸和15毫升浓盐酸清洗一个500毫升的锥形瓶和一个大磁力搅拌子。用酸洗液润湿锥形瓶的整个内表面。

然后用无核酸酶的水冲洗烧瓶，并让烧瓶自然干燥。加入100毫升1毫摩尔的三氯化金溶液。用一张铝箔纸覆盖经酸处理过的锥形瓶瓶口，置于加热板上持续搅拌并加热至沸腾。

接下来，加入10毫升38.8毫摩尔的柠檬酸钠。颜色将在数分钟内从无色或灰色变为深蓝色或黑色，最终变为深红色。停止加热后继续搅拌10分钟。

让金纳米颗粒悬浮液冷却至室温，然后在持续搅拌下加入110微升DEPC。用铝箔完全包裹整个烧瓶，并让DEPC处理过夜孵育。第二天，对金纳米颗粒悬浮液进行高压灭菌。

然后冷却至室温，并通过孔径为0.22微米的醋酸纤维素膜过滤。将过滤并经高压灭菌的金纳米颗粒储备液避光保存于4°C。按照文本方案中所述方法计算金纳米颗粒的浓度。

此处通过动态光散射测定，计算得到浓度为10纳摩尔，粒径为15纳米。采用标准亚磷酰胺化学法购买或合成可结合可卡因的适配体序列。使用标准脱盐方法纯化适配体后，将寡核苷酸溶解于无核酸酶的水中，配制成100微摩尔或1毫摩尔的储存溶液。

分装的纯化适配体可在20摄氏度下保存数月。将DNA与10纳摩尔的储备金纳米颗粒溶液混合，根据需要调整金纳米颗粒的体积，以提供足够的样品用于检测。室温避光孵育混合物3至4小时。

加入等体积的 20 毫摩尔 HEPES、2 毫摩尔氯化镁、pH 7.4 的缓冲液，将样品置于 4 摄氏度避光过夜。通过盐滴定法诱导检测显色反应所需的初始盐浓度由检测空白样确定。在 96 孔板中，向 180 微升的适配体-氯金酸检测样品分装液中加入 20 微升甲醇。

进行这些检测时的一个关键步骤是确定氯化钠浓度，以便在加入目标物后使金纳米颗粒失稳。用逐渐增加体积的氯化钠储备溶液对样品进行滴定，并确定其等当点。此处通过肉眼观察，确定引起最轻微颜色变化所需的氯化钠体积。

为优化检测响应，将20微升溶于甲醇中的分析物分子加入96孔板中180微升的适体-金纳米粒子检测试剂等分试样中，在室温下进行反应。立即加入上一步确定的氯化钠浓度，以启动检测的颜色响应。通过调整氯化钠浓度并比较目标响应与空白响应，获得尽可能大的颜色变化。

使用能够产生最大响应差异的氯化钠浓度。在加入氯化钠后150秒观察或测量检测反应。使用分光光度计在650纳米和530纳米处分析吸光度。

以650纳米和530纳米处测得的吸光度比值对分析物浓度作图。将检测响应信号相对于空白信号进行归一化处理。按照视频前面所述方法制备适体-金纳米颗粒检测的组分。

分别配制含有1克/毫升海藻糖和1克/毫升蔗糖的溶液，使用无核酸酶水制备冷冻保护液。因此，冷冻这些检测样品的关键步骤是确定需向样品中添加多少海藻糖和蔗糖溶液，以确保完全且均匀的冷冻。将60 MN4 DNA每金纳米颗粒检测体系配制成终体积为200微升的溶液，其中含有19.2毫克/毫升海藻糖和4.8毫克/毫升蔗糖，置于1.5毫升微量离心管中。

最终冷冻保护剂溶液的浓度需根据DNA覆盖度进行调整。使用-146摄氏度的超低温冰箱或液氮对样品进行速冻。将样品冷冻保存至使用前。

本实验中，将样品置于 146 摄氏度冰箱中过夜，随后转移至 20 摄氏度冰箱进行长期保存。图中显示的是未经处理与经 DNA 适配体处理的金纳米颗粒的氯化钠滴定曲线的代表性结果。实验中所用的初始氯化钠浓度通过滴定法确定。

此处展示了适配体-金纳米粒子比色法检测可卡因及对照分子的代表性结果。图表揭示了DNA覆盖密度的增加对可卡因检测假阳性反应率的影响。图中所示为通过比色法照片图像分析获得的可卡因检测校准曲线图。

使用智能手机拍摄的照片。此处展示了适配体-金纳米粒子比色法对可卡因及对照分子的检测反应的代表性结果。数据比较了新鲜制备的样品与冷冻保存长达四周的样品。

在进行该实验操作时，确定适当的氯化钠浓度以破坏金纳米颗粒的稳定性，并在加入目标物后引发典型的颜色变化，这一点至关重要。因此，在观看本视频后，您应能够充分理解如何开发基于金纳米颗粒适体的比色法检测体系，用于检测目标物质。您可以采用此处所述的方法来降低假阳性反应率，并确保您的检测体系在一个月以上的时间内保持有效。