从细胞提取物中分离和鉴定核糖核蛋白复合物中mRNA、microRNA及蛋白质组分的RIP-Chip方法

本视频旨在演示利用免疫沉淀方法从细胞提取物中分离和鉴定核糖核蛋白复合物的RNA及蛋白质组分的技术。大家好，我叫Garrett Dom，是密苏里大学分子、微生物学与免疫学系的研究生，在Eli Sso博士的指导下开展研究。随着高通量测序和高效微阵列分析技术的进步，全局基因表达分析已成为许多科研和疾病模型中简便且广泛可及的数据采集方式。

然而，目的基因 mRNA 的稳态水平并不总是与蛋白质的稳态水平直接相关。转录后基因调控可能是导致两者差异的原因，这一过程主要由 RNA 结合蛋白的相互作用所驱动。

转录后调控通过与靶标 mRNA 形成核糖核蛋白复合物，影响 mRNA 的定位、稳定性和翻译。从细胞提取物中鉴定该复合物内未知的从头合成 mRNA 靶标，对于理解 RNA 结合蛋白的作用机制、功能及其对蛋白质表达水平的影响至关重要。本方案介绍了一种称为核糖核蛋白免疫沉淀（ribo protein immunoprecipitation，简称 RIP）的方法，可用于鉴定与核糖核蛋白复合物特异性结合的 mRNA 分子。

实验开始前，必须准备好所有试剂、容器和器皿。为获得无RNA酶的玻璃器皿，需使用RNase抑制剂（如Ambion公司的RNA ZAP）处理，随后用经DEPC处理的水冲洗。确保所有试剂均已确认为无RNA酶。该实验的第一步是从细胞裂解液中收获核糖核蛋白复合物：收集处于对数生长期的组织细胞，每份样品通常需获得2至5毫克总蛋白，一般使用两个P150培养皿即足够。

在此实验中，我们正在收集 MB 2 31 和 MC 7 人乳腺癌细胞系，并研究RNA结合蛋白的核糖核蛋白相互作用。需要注意的是，针对每一种被研究的RNA结合蛋白，必须优化总细胞数量和蛋白用量，以最大程度地促进目标mRNA与RNA结合蛋白之间的相互作用。在4°C条件下，以1000 RPM离心约8至10分钟收集细胞，随后用预冷的PBS洗涤三次。最后一次洗涤后，轻轻弹击管底，将细胞沉淀重悬于等体积的含有RNase和蛋白酶抑制剂的预配多聚体裂解缓冲液中。

建议准确量取细胞沉淀的体积，轻轻吹打混匀以充分分散细胞团块，并将裂解液置于冰上孵育5分钟。在4°C条件下以13,000 G离心20分钟，以去除细胞碎片，立即收集上清液并转移至预冷的无RNA酶的微量离心管中，保持在冰上，并于-80°C保存。

该裂解液可在零下80摄氏度保存长达六个月。避免反复冻融，因为这可能导致蛋白质和/或mRNA降解。最好立即进行免疫沉淀（IP）。

使用标准的Bradford蛋白测定法快速定量蛋白浓度和裂解液。接下来，我们需要准备材料以分离我们感兴趣的特定蛋白。首先预溶胀蛋白。

将Sphero珠子在含有5% BSA的NT2缓冲液中4°C下过夜孵育。使用NT2缓冲液以4:1的比例与PAS珠子混合。可在4°C下长期保存，保存时间可达数月。

使用前若添加0.1%叠氮化钠，需去除过量的NT2缓冲液，使最终磁珠与缓冲液的比例为1:1。采用1.5毫升无RNA酶的微量离心管，每份独立的免疫沉淀反应中加入100微升SRO高速裂解液，并加入30微克抗体。例如，在我们的实验中使用的是who are抗体，这是一种小鼠IgG1抗体。

因此，我们的对照抗体也是IgG型。接下来，向抗体-磁珠混合物中加入100至200微升NT2缓冲液。此外，应平行使用同型匹配的抗体或来自同一物种的正常全血清作为抗体对照，以排除背景RNA的干扰。

向珠子混合物中加入适量抗体，置于4°C下旋转孵育过夜。使用前立即制备抗体包被的珠子：用1毫升预冷的NT2缓冲液洗涤5次，每次在4°C下以13,000 G离心1至2分钟以洗涤珠子。用移液器或抽吸装置小心去除上清液。

此洗涤步骤有助于去除抗体混合物中未结合的抗体以及RNA污染物。完成最后一次洗涤后，将磁珠重悬于700微升预冷的T2缓冲液中，随后加入多种RNA抑制剂以保护目标mRNA，包括10微升RNAs、10微升100毫摩尔DTT和15微升EDTA。用NT2缓冲液将终体积调至900微升。

接下来，我们将对目标复合物进行免疫沉淀。我们强烈建议使用预清除步骤，以降低RIP实验后RNA分析中的背景信号。请在4°C下，用15微克同型对照抗体预清除30分钟。加入50微升预先溶胀的未包被抗体的PAS珠。

在4°C条件下旋转孵育30分钟，随后在4°C下以10,000 G离心。收集沉淀。保留上清液用于免疫沉淀。

接下来，将约含2至5毫克蛋白质的100微升已纯化的澄清裂解液加入制备好的抗体混合物中。稀释裂解液有助于降低背景；包裹管体并用封口膜密封，确保封闭严密，于4°C翻转孵育4小时。随后在4°C、5,000 ×g条件下离心5分钟，收集沉淀中的珠粒，并将上清液保留用于后续潜在分析，按前述方法储存于-80°C。用1毫升冰预冷的TNE2缓冲液重悬珠粒，离心洗涤5次。

然后使用手动移液器或抽吸装置去除上清液。为了通过在 NT2 缓冲液中添加脱氧胆酸钠、尿素或 SDS 来降低背景信号，可采用更严格的处理方法。尽量将样品保持在冰上，并快速操作，以尽量减少靶 mRNA 的降解。

最后，我们将使用DNA和蛋白酶K处理，随后进行RNA沉淀，以在用100 µL含5 µL无RNase的DNase I的N NT 2缓冲液洗涤并重悬磁珠后，分离核糖核蛋白中的RNA。将样品置于37 °C孵育5至10分钟。加入1 mL N NT 2缓冲液，于5,000 ×g离心5分钟。

弃去上清液，将SROs沉淀重悬于100微升NT2缓冲液中，加入5微升浓度为10毫克/毫升的蛋白酶K以及1微升10% SDS，于55°C水浴中孵育30分钟，每10分钟轻轻振荡一次。蛋白酶K有助于释放核糖核蛋白组分。离心收集珠粒沉淀。

在室温下以 5,000 G 离心五分钟，收集上清液，体积约为 100 微升。接下来向两粒磁珠中加入 200 微升 NT2 缓冲液，于 5,000 G 离心两分钟。收集约 200 微升上清液，弃去磁珠。

混合 super natin，加入 300 µL 下层酸性酚溶液，涡旋震荡 1 分钟，室温孵育 1 分钟，然后室温下以最大速度离心 1 分钟。收集 250 µL 上层液体。

务必小心，不要扰动界面，以免造成污染。在RNA样品中加入25 µL pH为5.2的乙酸钠、625 µL预冷的100%乙醇以及5 µL甘油蓝（glyco blue），充分混匀后于-20 °C过夜保存。

此外，为确保 RNA 的充分回收，加入糖蓝（glyco blue）可作为载体分子，提高次日 RNA 沉淀的可见性。将试管轻轻颠倒混匀三至五次，然后在 4°C 下以 12,000 G 离心 30 分钟，并弃去上清液。向蓝色沉淀中加入 1 毫升预冷的 70% 乙醇，通过颠倒或涡旋混匀后离心。

在4 °C条件下，以12,000 G离心样品2分钟。弃上清，于4 °C、12,000 G再离心1分钟。用移液器除去残留的70%乙醇，空气干燥沉淀。

室温孵育五分钟。加入 20 至 40 微升（µL）无 RNase、无 DNA 的水重悬。样品现可用于 NanoDrop 分光光度法进行定量，并可用于后续实验，如定量实时 PCR 或微阵列分析。在 RNA 分离后，通过微阵列和定量实时 PCR 分析，揭示 RNA 结合蛋白 who are 的 mRNA 靶标及其在免疫沉淀中的富集情况。

通过蛋白质印迹法验证，证实了目标蛋白的纯净分离。定量 PCR 结果显示，与 IgG 对照组相比，mRNA 靶标 β-actin 的富集倍数显著增加。尽管微阵列分析揭示了 MC7 与 MDA-MB-231 乳腺癌细胞系之间独特的基因表达谱，但总体而言，核糖核蛋白免疫沉淀技术已被我们研究团队及其他多个研究团队确立为一种优异的工具，用于分离并研究 RNA 结合蛋白与其 mRNA 靶标之间的相互作用。尽管该方法在本质上和操作中较为敏感，但只要正确执行实验流程，即可成功分离这些核糖核蛋白复合物——而这些复合物在近期之前尚无法被发现和分析。