使用组织特异性水凝胶生物墨水打印细胞化结构

本实验方案的总体目标是展示一种多功能方法，用于设计可通过生物打印设备挤出的水凝胶生物墨水。这些生物墨水随后可用于制造三维组织结构。该方法有助于回答生物打印领域中的关键问题，例如如何调控所需的力学性能，以提供一种可利用生物打印机进行挤出的材料。

该技术的主要优势在于，我们采用市售组件以模块化方式组合，制备出一种简单且高效的可生物打印水凝胶生物墨水。这些技术的应用包括构建三维组织类器官，可用于精确模拟药物、毒素及疾病的影响。尽管该方法可为三维肝组织的生物打印提供框架，但也同样适用于其他组织类型，如肌肉、肺和结肠组织。

通常，初次接触该方法的人可能会遇到困难，因为制备水凝胶生物墨水需使用多种不同的试剂，但实际上该过程相当直接。本次操作演示将由本团队的博士后 Young-Joon Seol 进行。首先，按照其他文献所述方法，制备用于水凝胶配方中的组织特异性细胞外基质消化液。

然后，将光引发剂以0.1%的质量体积比溶解于水中。为了制备水凝胶生物墨水，首先将透明质酸水凝胶试剂盒中的基础材料组分分别溶解于上述含光引发剂的水溶液中。接着，按照此处所示比例，将细胞外基质（ECM）溶液、2%巯基化透明质酸、2%巯基化明胶、交联剂以及肝细胞培养基混合。为改善生物墨水的挤出性能，向混合物中添加1.5毫克/毫升未修饰的透明质酸和30毫克/毫升明胶。

然后，在使用前将所得混合物在高速下涡旋震荡十秒钟。在将生物墨水用于生物打印设备之前，首先在实验台上测试其挤出特性。使用标准注射器，取少量生物墨水样品，然后在注射器上安装一根20至30号的针头。

让生物墨水交联，然后通过针头推出生物墨水，以获得平滑挤出的水凝胶细丝。如果该配方能够形成少凸起或无凸起的细丝，则表明其已准备好用于生物打印。将生物墨水装载至生物打印机时，使用移液器将生物墨水加入已灭菌的打印机 cartridge 中。

让其静置30分钟后再进行挤出，因为生物墨水会在 cartridge 内自发进行第一阶段交联。接下来，将 cartridge 装入打印装置，并将气动压力源连接至 cartridge。准备一个简单的图案，例如这种7毫米×7毫米的平行线网格，用于打印以评估其挤出兼容性。

当打印头在XY平面以约300毫米/分钟的速度移动时，对 cartridge 施加20千帕的压力以挤出生物墨水。如果挤出材料呈块状或不规则，应减少加入的交联剂用量，以软化第一阶段交联的材料。配制合适的生物墨水应能平稳挤出，实现精确沉积和结构成型。

采用悬滴法在96孔板中制备三维原代肝细胞球体，具体步骤详见配套的文字方案。培养三天后，使用移液器从悬滴板中收集肝细胞球体，并转移至无菌的15毫升锥形管中。静置1至2分钟，使细胞球体沉降至锥形管底部。

然后，用移液器小心吸除培养基。将新配制的水凝胶生物墨水溶液转移至含有类球体的锥形管中，转移体积为所需打印的3D结构体积的110%至125%。接着，轻轻吹打类球体，使其在水凝胶生物墨水溶液中重新悬浮。

待其均匀悬浮后，使用移液器将类球体溶液转移至生物打印 cartridge 中，并让溶液经历第一阶段交联，持续 30 分钟。完成第一阶段交联后，利用生物打印设备制备含有原代肝类球体的目标水凝胶结构。每沉积一层后，将打印出的生物墨水暴露于紫外光下 2 至 4 秒，以启动第二阶段交联机制。

这将稳定构建物并使刚度达到所需水平。溶液中 PEG 炔烃的浓度决定了整体交联密度，因而主要控制最终构建物的刚度。生物打印后，通过共聚焦显微镜观察到肝构建物中细胞存活率较高。

在最佳环境条件下，细胞存活率应高于85%。此外，当对类器官进行肝组织标志物染色时，观察到细胞色素P450同工酶CYP3A4、细胞内白蛋白、上皮细胞间黏附蛋白E-cadherin以及在肝脏中高表达的DPP4均呈阳性表达。当检测培养基中尿素和白蛋白的水平时，发现该类器官在14天的培养过程中持续稳定地分泌尿素和白蛋白。这进一步表明，组织特异性水凝胶生物墨水有助于维持肝细胞的功能。

一旦掌握，若操作得当，完成该技术从开始到结束大约需要两个小时。然而，这通常取决于所使用的特定生物打印设备。在尝试该操作流程时，需牢记所展示的步骤往往需要根据其他组织类型或生物打印设备进行相应调整。

通过此方案，可开发其他水凝胶生物墨水配方，以支持其他组织类型的生物打印。这些技术的发展为构建用于药物筛选和疾病建模的多类器官“芯片上器官”平台奠定了基础。观看本视频后，您应能够充分理解如何开始设计可用于通过多步交联方法进行三维组织结构生物打印的材料。

请注意，使用紫外光可能对视力造成极大危害，因此在进行此操作时，应始终采取预防措施，例如佩戴防紫外线护目镜。