扩增 大肠杆菌 在连续流动PCR微流控芯片中的扩增及其通过毛细管电泳系统的检测

本方案介绍了如何基于微流控芯片构建连续流动聚合酶链式反应系统，以及如何在实验室中搭建毛细管电泳系统。它提供了一种在实验室中分析核酸的简便方法。聚合酶链式反应是一种用于扩增目的基因的传统方法。

然而，由于传统PCR的温度变化效率较低，因此耗时较长。本研究提出了一种基于微流控芯片的连续流动PCR系统。通过将PCR溶液引入置于不同温度加热器上的微通道中，可显著缩短扩增时间。

由于毛细管电泳（CE）具有分辨率高、速度快和重复性好等多种优势，已成为实验室中分析核酸和蛋白质的常用工具。然而，大多数实验室，特别是发展中国家的实验室，因毛细管电泳仪器价格昂贵而难以负担该技术。本文概述了在实验室中如何制备CF-PCR微流控芯片以及如何搭建多功能毛细管电泳系统的操作方案。

我们还演示了利用CF-PCR系统对大肠杆菌（Escherichia coli）进行扩增，以及通过毛细管电泳（CE）系统检测PCR产物的过程。按照本方案所述步骤操作，即使资源有限，用户也应能够制备微流控芯片、配制PCR溶液、搭建用于核酸扩增的CF-PCR系统，并建立一个简单的CE系统以分离DNA片段。将硅片在200摄氏度下加热25分钟，以去除水分。

每英寸晶圆分配一毫升 SU-8 2075 光刻胶。使用匀胶机在硅片上旋涂，先以每秒 100 转的加速度在 500 rpm 下旋转 5 至 10 秒，再以每秒 500 转的加速度在 2,000 rpm 下旋转 30 秒。随后在 65°C 下预烘 3 分钟，再在 95°C 下预烘 15 分钟。

将光刻机的曝光能量设置为150至215毫焦耳每平方厘米，并使用光刻掩模将设计好的图案刻蚀到光刻胶上。将硅片和掩模准备就绪以进行曝光。曝光后，先在65摄氏度下烘烤硅片2分钟，再在95摄氏度下烘烤7分钟。

将硅片浸入显影液中以去除多余的光刻胶，当微通道可见时取出。然后用异丙醇冲洗掉残留的显影液。按10:1的比例混合聚二甲基硅氧烷预聚物与固化剂。

将混合好的PDMS溶液倒入复制模具中，在80摄氏度下固化60分钟。使用等离子清洗仪活化后，立即将PDMS微流控芯片键合到载玻片上，并在80摄氏度下继续固化30分钟。使用涡旋混合器和离心机确保试剂充分混匀。

准备一个离心管。首先向离心管中加入水，然后依次加入DNA模板、引物、缓冲液、dNTP混合物、Tween 20、PVP，最后加入DNA聚合酶。

最后，通过涡旋振荡混合溶液。准备两个PTC陶瓷加热器、两个固态继电器、两个温度控制器、两个温度传感器和一根电源线。将加热器连接至固态继电器。

将固态继电器连接至PID温度控制器。然后将温度传感器探头固定在两个加热器的底部，并将接线端连接至PID温度控制器。最后，将两个固态继电器串联连接，并接入电源线。

为两个加热器3D打印一个插槽，并将加热器保持在同一平面上。将微流控芯片放置在两个加热器上。准备一个注射泵和一个注射器，然后将注射器固定在注射泵上。

连接带有注射器的硅胶管，并将不锈钢针头连接到硅胶管的顶端。将不锈钢针头插入微流控芯片的入口。在芯片出口处放置一个移液器吸头，用于收集PCR产物。

使用高压电源产生脉冲电场。看，这是一个高压电源。这些是正极和负极电极。

使用汞灯作为光源，并通过滤光片筛选汞灯的激发波长。将毛细管置于显微镜载物台上。利用物镜收集荧光发射信号，然后通过光电倍增管进行检测。

这是我们的显微镜，这是我们的毛细管。现在我们在暗室条件下打开光源。激发光由物镜收集。

使用自主开发的LABVIEW软件控制电源并完成数据采集。将CF-PCR系统的加热器温度预设为65摄氏度和95摄氏度。将微流控芯片放置在两个加热块上。

将硅胶管的管尖插入含有50 µL PCR溶液的离心管中。拉动注射器活塞，缓慢吸取溶液。将注射器固定在注射泵上。

将钢针插入微流控芯片的入口。将泵的流速设置为每分钟10微升，按下启动按钮，推动溶液进入微芯片入口处的微通道。在微流控芯片的出口处收集PCR产物。

准备一根总长度为8厘米、有效长度为6厘米的毛细管。通过混合100微升1% HEC、2微升100倍稀释的SYBR Green和98微升超纯水，配制含有1倍稀释SYBR Green的0.5% HEC分离缓冲液。使用真空泵将分离缓冲液注入毛细管中。

在软件界面中输入进样电压和进样时间，点击开始按钮，等待PCR产物通过电动力学方式进入毛细管。在软件界面中输入直流电压，点击开始按钮，以每厘米电场强度100伏的条件进行电泳。待所有DNA片段在毛细管中完全分离后，点击停止按钮。

每次运行后用无菌水冲洗毛细管一分钟。此图表示PCR产物和DNA标记物的电泳图谱。我们首先在CF-PCR系统中扩增了大肠杆菌（Escherichia coli）的目标基因，PCR溶液从芯片入口到出口耗时约10分钟30秒。

大肠杆菌目标扩增片段的大小为544 bp。随后，我们在毛细管电泳系统中分析了扩增的PCR产物。此外，我们还在相同的实验条件下对100 bp DNA Ladder进行了毛细管电泳。

可根据DNA标记物的电泳图谱评估PCR产物的大小。每次实验均重复三次以确保可重复性。本图数据显示，经分离后可观察到对应于大肠杆菌PCR产物的峰，且微流控芯片中PCR产物的迁移时间与在热循环仪中的迁移时间一致。

PCR 和毛细管电泳（CE）是核酸分析中两种常用的生物技术。本文介绍了利用自行构建的 CF-PCR 和 CE 系统对大肠杆菌进行扩增并检测其 PCR 产物的方法。目标基因在 10 分钟内成功扩增，小于 1,500 bp 的 DNA 片段在八分钟内实现分离。

此外，本研究中基于微流控芯片和毛细管电泳（CE）系统的CF-PCR系统易于制备，可能为实验室中核酸分析提供一种简便的方法。然而，该系统一次只能扩增和检测一个样本，限制了其广泛应用。因此，开发用于病原体高通量检测的集成化CF-PCR与CE微流控芯片阵列仍处于推进过程中。