通过特异性鉴定细胞周期蛋白依赖性激酶1的磷酸化位点 体外 激酶活性检测

本体外激酶实验的总体目标是鉴定目的蛋白中特异性由细胞周期蛋白依赖性激酶1（cyclin-dependent kinase 1）介导的磷酸化位点。鉴定CDK1特异性的磷酸化位点至关重要，因为这些位点可提供关于CDK1如何调控细胞周期的机制性见解。细胞周期的调控对于完整的染色体分离至关重要，其缺陷会导致染色体异常并引发癌症。

该技术的主要优势在于其依赖于纯化的蛋白质，因此可应用于任何模式生物，并产生可靠的结果，尤其是与细胞内的功能研究相结合时。该方法具有重要意义，因为尽管CDK1可磷酸化约8%至13%的蛋白质组，目前已知的CDK1靶点数量仍然较少。尽管该方法用于鉴定CDK1特异性的磷酸化位点，但只要获得纯化的激酶，该方法也可经修改后用于鉴定其他激酶的磷酸化位点。

通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为激酶反应的条件需要针对每个靶蛋白进行优化，以获得高效的磷酸化效率。理想情况下，磷酸化效率应达到100%。使用IGPS 3.0软件并访问其网络服务器，以预测CENP-F靶蛋白序列中CDK1特异性的磷酸化位点。将预测出的磷酸化位点与CDK1的共识序列进行比对验证。

通过制备预培养物开始蛋白表达。根据制造商说明书，将一微升表达质粒转入五十微升大肠杆菌感受态细胞中。加入质粒后，将细胞置于冰上孵育三十分钟。

然后将细胞在 42 摄氏度下孵育 45 秒。孵育结束后，将细胞置于冰上 1 分钟，然后向细胞中加入 400 µL LB 培养基，随后在 37 摄氏度下振荡培养 1 小时。然后取 200 µL 培养物接种至含有相应抗生素的 LB 琼脂平板上，具体抗生素种类根据构建质粒而定。

接下来，将平板在37摄氏度下孵育12至20小时，期间不进行振荡。然后从LB琼脂平板上挑取一个菌落，将其接种于50毫升含有所需抗生素组合的LB培养基中。将培养物在37摄氏度下以每分钟160至180转的速度振荡培养12至20小时。

每升 LB 培养基中加入抗生素和 10 毫升 40%（质量/体积）的无菌过滤葡萄糖溶液。向该培养基中加入 20 毫升高密度预培养菌液，然后在 37 °C、160 至 180 转/分钟振荡条件下培养。

定期检测培养物在 600 纳米处的吸光度。当吸光度达到 0.5 至 0.6 时，加入 0.2 毫摩尔的 IPTG 以诱导蛋白表达。随后将培养物在 37 摄氏度下振荡培养三小时。

离心收集细胞：将培养物在4℃条件下以4,100 × g离心15分钟（使用水平转子），离心结束后弃去上清液。每升培养物用20毫升GST结合缓冲液重悬CENP-F的细胞沉淀，或用20毫升his六结合缓冲液重悬karyopherin alpha的细胞沉淀。

然后将细胞储存在负80摄氏度。为纯化CENP-F，首先解冻含有CENP-F质粒的细胞，然后用GST结合缓冲液将体积调至20毫升。

调整体积后，依次加入所有还原剂和蛋白酶抑制剂，以制备用于后续裂解的细胞悬液。接着将细胞悬液转移至玻璃烧杯中，并将烧杯浸入冰水浴中。然后对培养物进行超声处理。

超声处理后，向裂解液中加入250微摩尔的PMSF，然后观察裂解液，此时应呈透明状态。随后在4摄氏度下以12,000至40,000 ×g离心25分钟。接下来，通过向一次性层析柱中加入2毫升谷胱甘肽琼脂糖1:1悬浮液来准备层析柱。

用25毫升超纯水冲洗层析柱以平衡，随后再用25毫升GST结合缓冲液冲洗。离心结束后，倾去上清液，然后将上清液通过孔径为0.2微米的滤膜过滤。接下来，将裂解液倒入已装填的层析柱中，进行结合步骤。

盖上柱子，在4 °C条件下轻轻振荡孵育30分钟，避免产生泡沫。30分钟后，将柱子转移至支架上，静置使树脂沉降。随后收集穿流液，并用25 mL GST结合缓冲液洗涤柱子两次。

洗涤完成后，再次封闭柱子。然后向柱中加入400微升GST结合缓冲液和250微升PS蛋白酶储备液（活性为每毫克1000单位）。再次盖紧柱子，轻轻涡旋以将树脂重悬于缓冲液中，随后将柱子置于4摄氏度孵育16至20小时。

孵育期结束后，加入4 mL GST结合缓冲液，以洗脱已通过蛋白酶切从柱子上释放的CENP-F片段。接下来，为再次洗脱GST标签，将柱子堵住，然后向柱子中加入含谷胱甘肽的4 mL GST洗脱缓冲液。

接下来，将层析柱孵育10分钟，以洗脱结合的GST标签。10分钟后收集洗脱液。然后进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，分析PS蛋白酶和谷胱甘肽洗脱组分。

接下来浓缩蛋白质样品，将PS蛋白酶洗脱液用移液器转移至超滤离心管的上层室中，该超滤管的截留分子量为3千道尔顿。然后在4°C条件下，使用摆动转子离心机以4,100 × g离心10至15分钟，逐次进行，以浓缩样品。每次离心后，通过轻轻吹打混匀浓缩滤膜中的蛋白质样品，避免形成浓度梯度。

为通过凝胶过滤纯化CENP-F，将凝胶过滤柱连接至快速蛋白液相色谱系统。随后用一个柱体积的凝胶过滤缓冲液平衡层析柱。接着将CENP-F片段在微量离心管中于4°C条件下以21,700 × g离心20分钟。

离心结束后，将样品注入层析柱，然后用凝胶过滤缓冲液洗脱层析柱，并收集含有CENP-F片段的0.6毫升组分。接着分析凝胶过滤图谱，并对主峰组分进行SDS-PAGE电泳。合并含有纯CENP-F的组分。

然后将纯化的CENP-F片段浓缩至3.3毫克/毫升。为测定蛋白浓度，将CENP-F片段与超纯水按1:100的比例稀释。接着在分光光度计中记录220至300纳米波长范围的光谱。

接下来，将纯化的CENP-F分装至0.5毫升微量离心管中，每管50微升，然后在液氮中速冻，并于-80摄氏度保存。进行激酶反应时，在0.5毫升微量离心管中将CENP-F片段与ATP及CDK1-cyclin B以及其他缓冲液混合。另准备一个不含CDK1-cyclin B的样本作为阴性对照。

然后将样品在30摄氏度的水浴中孵育1至16小时。为了通过质谱成功鉴定磷酸化位点，关键在于磷酸化效率应尽可能高，最好达到100%。为提高磷酸化效率，可添加更多的激酶，并将孵育时间延长至16小时。随后，向剩余的激酶反应体系和阴性对照中加入等体积的6摩尔盐酸胍溶液，并进行质谱分析以鉴定磷酸化位点。

为了获得高质量的质谱数据，纯化的蛋白质样品必须具有高纯度和均一性。首先进行SDS-PAGE分析，结果显示与不含CDK1的阴性对照相比，磷酸化的CENP-F在凝胶上出现明显的条带向上迁移，表明CENP-F的cNLS是CDK1的底物。接下来进行质谱分析，以检测CENP-F磷酸化位点的数量及其磷酸化效率。

完整体外磷酸化的CENP-F的ESI离子阱质谱显示存在五个峰，表明有四个磷酸化位点，其中第五个峰为未磷酸化的蛋白质。接下来，该尺寸排阻洗脱谱显示，在加入野生型CENP-F后，karyopherin α峰的洗脱体积向更高分子量方向偏移，而加入CENP-F突变体后未观察到此现象。这表明CENP-F的磷酸化模拟突变体S3048D会减弱CENP-F cNLS与karyopherin α之间的相互作用。

最后的SDS-PAGE分析结果显示，具有完整cNLS的野生型CENP-F片段与karyopherin alpha共洗脱，表明两者之间存在强相互作用；而CENP-F的S3048D突变体与karyopherin alpha则在不同的洗脱峰中出现。在进行该实验操作时，需注意将获得的磷酸化位点与CDK1的共识磷酸化序列进行比对，并确认所鉴定的底物与CDK1定位于相同的细胞区域。

在完成此操作步骤后，应在细胞或动物模型中进行功能验证，以确认所鉴定的磷酸化位点具有生理功能。目前已有多种工具可用于功能验证，例如特异性的CDK1抑制剂和磷酸化模拟突变。由于蛋白质组中存在大量CDK1底物，许多人类CDK1底物仍有待发现，而体外激酶实验将成为鉴定、定位和验证这些位点的重要工具。

鉴定这些磷酸化位点有助于深入研究CDK1调控细胞周期的作用机制。观看本视频后，您应能够充分理解如何通过体外激酶实验鉴定CDK1特异性的磷酸化位点及其靶蛋白。