冻干环介导等温扩增试剂的开发及其在检测中的应用 Coxiella burnetii

本实验的总体目标是开发一种使用冻干试剂的简单LAMP方法，用于检测患者样本中的贝氏柯克斯体（C. burnetii）。该方案的主要优势在于试剂储存无需冷链运输和保存。此方法非常适合于Q热流行且资源有限的地区使用。

为我们演示该实验步骤的是本实验室的技术员 Tatiana。首先，从贝氏柯克斯体 RSA493 的目标基因 IS1111a 的 DNA 开始，使用分光光度计在 260 纳米处测定质粒 DNA 的浓度。利用以下计算公式将质粒 DNA 浓度转换为拷贝数，其中 6330 为质粒的长度（碱基对），34.2 纳克/微升为使用分光光度计刚刚测定得到的质粒浓度。

然后对质粒进行8至10倍的系列稀释，以获得每微升中以下数量的拷贝数。为准备LAMP反应的DNA模板，取200微升人血浆样本，使用DNA小量提取试剂盒，按照制造商提供的操作说明提取DNA。将最终样品稀释至20微升体积。

通过混合以下试剂制备1毫升2倍LAMP反应缓冲液，短暂涡旋振荡10秒以混匀。进行标准LAMP反应时，在0.2毫升PCR管中加入12.5微升2倍LAMP缓冲液、1.2微升引物混合物、1微升Bst DNA聚合酶和5.3微升水。

接下来，向20微升反应体系中加入5微升DNA，充分混匀，然后在60摄氏度的水浴或加热块中孵育60分钟。孵育结束后，向反应管中加入5微升10×凝胶上样缓冲液以终止反应。随后，取5微升反应产物上样至含有核酸嵌入染料的2%琼脂糖凝胶中。

在1×TBE缓冲液中以100伏电压电泳35分钟，然后使用紫外光观察结果。使用重建的试剂进行LAMP反应时，通过混合以下试剂制备1毫升重建缓冲液。脉冲涡旋振荡10秒以混匀。

接下来，从密封的铝箔袋中取出装有冻干试剂的试管。在进行步骤 4.2 时，打开铝箔袋前必须确保其已正确密封。如果铝箔袋未密封或已破损，请勿使用其中的试管。

向每管试剂中加入20 µL重悬缓冲液，通过上下吹打5次混匀。确保冻干试剂完全重悬。然后，向重悬的试剂中加入5 µL DNA模板，并充分混匀。

在60摄氏度的水浴或加热块中孵育60分钟。孵育结束后，加入5 µL的10x上样缓冲液以终止反应，然后将5 µL反应产物上样至含有嵌入式核酸染料的2%琼脂糖凝胶。在1x TBE缓冲液中以100伏电压电泳35分钟，随后用紫外光观察结果。

使用羟基萘酚蓝（HNB）或嵌入性染料进行LAMP反应时，通过混合以下试剂（包括HNB或荧光嵌入染料）配制1毫升的复溶缓冲液。脉冲涡旋混匀10秒。按照前述方法进行LAMP反应，并使用紫外光或肉眼观察结果。

使用管式扫描仪进行LAMP反应时，将5微升DNA加入含有荧光嵌入染料的复溶试剂中，然后将封闭的反应管插入管式扫描仪。设置孵育温度为60摄氏度，并在60分钟内于520纳米处检测荧光信号。该图显示了使用新鲜配制试剂和冻干试剂进行LAMP反应后在琼脂糖凝胶上的结果。

观察冻干试剂保持其活性。使用两种试剂制备的LAMP反应均检测到25个拷贝的DNA模板。在本图中，显示了通过HNB或反应中嵌入型荧光染料对反应产物进行检测的结果。

在反应中加入HNB会导致颜色发生肉眼可见的变化，当反应体系中存在25、50和100个DNA模板拷贝时，颜色由紫色变为蓝色。此外，当DNA拷贝数相近时，反应中加入荧光嵌入染料可在紫外光照射下产生强烈的荧光信号。图中所示为使用试管扫描仪实时监测含荧光嵌入染料反应体系中荧光信号的结果。

在反应体系中含有 10^6、10^4、10^3 和 100 拷贝 DNA 模板的情况下，荧光信号分别在 14、18、21 和 23 分钟后高于基线。掌握该方法后，整个操作可在 90 分钟内完成。该检测方法建立后，为资源有限地区快速诊断贝氏柯克斯体（Coxiella burnetii）感染铺平了道路。

观看本视频后，您应充分了解如何重建冻干的 LAMP 试剂。请务必注意，患者样本可能具有传染性，因此在进行此操作时应始终采取安全防护措施。