毛细管阵列中多种核酸的可视化检测

本实验的总体目标是制备一种小型、即用型卡盒，可用于在单次简单操作的检测中实现对多种核酸的可视化检测。该方法有助于解决多重核酸检测领域中的关键问题，例如转基因生物（GMO）的检测。为清洁毛细管，请穿戴实验服、护目镜和化学防护手套。

将毛细管放入烧杯中。用30毫升丙酮清洗毛细管5分钟，以去除有机物。然后用去离子水冲洗毛细管。

接下来，通过将约十毫升过氧化氢倒入烧杯中来配制piranha溶液。然后，在缓慢摇动下将30毫升硫酸加入过氧化氢中，以防止过热。确保该溶液完全覆盖毛细管至少30分钟。

然后，用大量水冲洗掉piranha溶液。分别用乙醇和去离子水清洗毛细管，每次各五分钟。将毛细管放入干燥烘箱中干燥。

接下来，在一个50毫升的离心管中按1:1的比例称取PDMS基底和交联试剂。通常将5克弹性体基底与5克弹性体固化剂混合。用玻璃棒充分搅拌混合物约5分钟。

将盛有PDMS的烧杯放入真空干燥罐中抽真空脱气30分钟。然后，将PDMS缓慢倒入不锈钢模具的圆柱形腔内。将PDMS置于60°C的干燥烘箱中固化3小时。

固化PDMS后，将圆柱形模具拔出以去除模具。用手术刀切割模具边缘，将PDMS从圆柱上取下。用乙醇和去离子水各清洗PDMS三次。

然后，用氮气干燥PDMS支撑物。将PDMS支撑物的下表面浸入超疏水涂层中1秒，使其具有疏水性。随后，在室温下干燥10分钟。

接下来，将清洗后的4毫米毛细管插入PDMS支撑体的孔中，使毛细管有0.5毫米部分露出PDMS支撑体的上表面。确保毛细管的末端处于同一水平。为了使毛细管外表面和PDMS支撑体上表面具有疏水性，可在PDMS支撑体表面加入15 µL超疏水涂层。

将超疏水改性的毛细管阵列在空气中干燥。接着，根据预先设计的顺序，向毛细管阵列中的每个对应毛细管加入1.6 µL的一组引物固定混合液，以填充该毛细管。将阵列固定在标准平底96孔板的透明孔中，并在60 °C下干燥至少两小时。

组装卡带时，将加载接头置于固定阵列的顶部。确保接头的凹面完全覆盖所有十根毛细管的暴露部分。准备LAMP反应混合液时，按照文本方案将试剂加入混合物中，在加入煅烧粉（calcine）后，涡旋振荡反应混合物5秒钟。

加入Bst聚合酶后，轻轻倒置离心管20次。在处理LAMP反应混合物之前，使用一摩尔每升的盐酸进行清洁，可消除环境中存在的痕量DNA。使用标准的100微升吸头吸取20微升LAMP反应混合物。

将吸头插入上样适配器的入口以固定。轻轻将反应混合物注入适配器的样品槽中。反应混合物会迅速充满样品槽，并通过毛细作用自动加载至毛细管中。

取下带有锁紧尖端的适配器，并使用适用于PCR的透明密封膜密封反应孔。随后，将毛细管阵列置于63摄氏度的培养箱中孵育一小时。为获取荧光发射图像，使用紫外手电筒激发解离的钙黄绿素发出荧光。

使用数码相机或智能手机从毛细管阵列顶部拍摄图像。拍摄时，应尽可能将相机对准毛细管区域进行放大，以获得高质量、清晰的图像。随后，使用图像分析软件打开该图像。

然后选择图像、模式、灰度、是，以及图像、模式、16位、是。选择文件、另存为、格式、TIFF，将图像转换为16位TIFF格式。为提取荧光强度值，请打开微阵列分析软件。

将16位TIFF格式图像拖入软件界面，然后选择532纳米波长和绿色来显示图像。接着创建一个新的区块，用于定位毛细血管的荧光信号。选择工具、新建区块，然后在区块和特征界面中分别将列数和行数设置为1比1以及2到5。

右键单击并选择特征模型。然后调整位置和直径，使其与毛细血管的荧光区域相匹配。选择分析以提取荧光强度的数值。

最后，选择“文件”→“将设置另存为”，以保存该模块的文档；然后选择“文件”→“将结果另存为”，以保存荧光强度结果。此处显示的是毛细管阵列的布局。

1至8号毛细管，分别加入以LAMP引物组为前缀的反应体系。9号和10号毛细管为两个无引物对照。图中显示的是转基因玉米MON863的荧光检测结果，其中绿色表示LAMP扩增阳性。

成功扩增仅出现在预期的毛细管一、六、七和八中，空白毛细管之间无污染。该荧光照片用于检测转基因混合物，绿色表示LAMP扩增阳性。

仅在预期的毛细管一、四、五、六、七和八中观察到成功扩增，空白毛细管之间无污染。此处显示的荧光照片用于检测非转基因玉米，绿色表示LAMP扩增阳性。仅在预期的毛细管八中观察到成功扩增，且空白毛细管之间无污染。

一旦掌握，若操作得当，该检测程序可在 1.5 小时内完成。观看本视频后，您应能充分理解如何制备基于毛细管的检测卡盒，以进行多重核酸检测。