环介导等温扩增技术用于筛查 沙门氏菌 在动物饲料中检测并确认 沙门氏菌 从培养物分离

该沙门氏菌LAMP方法已被纳入美国食品药品监督管理局（FDA）《细菌学分析手册》，既可作为动物饲料中沙门氏菌的筛查方法，也可用于对所有疑似沙门氏菌分离株的确认。该方法快速、可靠且稳健。与PCR相比，其主要优势包括检测速度快、仪器设备简单、假阴性率低以及实验流程灵活。

对沙门氏菌等病原体进行快速筛查在及时发现潜在污染产品方面具有重要作用，可预防人类和动物的疾病或疫情暴发。首先准备用于LAMP检测的DNA模板。用于制备DNA模板的样本分为两种类型。

从动物性食品样品中制备模板时，将25克食品样品无菌称重至无菌滤袋中。向袋中加入225毫升无菌缓冲蛋白胨水，并在35摄氏度下孵育24小时。孵育结束后，从袋的滤过侧转移1毫升至微量离心管中。

将离心管在 900 × g 条件下离心一分钟。然后将上清液转移至新的微量离心管中。在 16,000 × g 条件下离心样品两分钟。

弃去上清液，将沉淀重悬于100 µL样品制备试剂中，并在干式加热块中100 °C加热10分钟。然后将样品冷却至室温，并于-20 °C保存。本LAMP检测的第二种样品直接来自疑似沙门氏菌培养物。

为制备DNA模板，将500微升过夜培养的沙门氏菌培养物转移至微量离心管中，置于100摄氏度的加热块中加热10分钟。随后将样品冷却至室温，并在负20摄氏度下保存。为防止交叉污染，应将LAMP预混液的配制区域与DNA模板添加区域在物理空间上分开。

使用异丙醇和降解DNA的溶液清洁工作台面。然后清洁移液器和试管条架。将等温扩增主混合液（isothermal Master Mix）、10倍引物混合液（10X Primer Mix）、分子级水、阳性对照DNA以及DNA模板在室温下解冻。

打开LAMP仪器，并输入相关的样品信息。根据手稿说明配制LAMP预混液，涡旋混匀后短暂离心，将23 µL预混液分装至八联管条的每个孔中。对所有DNA模板进行涡旋混匀，并短暂离心。

然后，向相应的孔中加入 2 µL DNA 模板，并 tightly 封盖。从支架上取下管条，轻弹管条以确保所有试剂均汇集于管底。将管条放入 LAMP 仪器中，并启动 LAMP 运行。

在LAMP反应进行过程中，轻触温度、扩增和退火标签，以查看LAMP运行期间各种参数的动态变化。LAMP结果可实时在LAMP仪器面板上查看，或通过LAMP软件查看。要在仪器面板上解读结果，请打开感兴趣的LAMP运行程序。

观察与每次运行相关的五个标签页。“配置”和“温度”标签页分别显示LAMP反应进行过程中各样品孔的程序设定温度和实际温度。“扩增”和“退火”标签页分别显示扩增阶段和退火阶段的荧光读数及荧光变化情况。

“结果”选项卡显示了LAMP结果的表格视图，可根据论文中的说明进行解读。查看LAMP结果的第二种方式是使用LAMP软件。要通过软件解读结果，请点击左侧面板上的计算机图标，并导航至文件所在位置，以加载感兴趣的LAMP运行数据。

观察每次运行关联的七个标签页。"概况"和"温度"标签页显示LAMP反应进行过程中各样本孔的程序设定温度与实际温度。"扩增"和"扩增速率"标签页显示扩增阶段的荧光读数及荧光变化情况。

“退火”和“退火衍生”标签页显示退火阶段的荧光读数及荧光变化情况。“结果”标签页以表格形式展示LAMP结果，包含图形名称、孔编号、孔名称和峰值四个字段。

显示了全部八个样本的扩增时间及退火衍生曲线。结果可依据文献中的方法进行解读。可通过LAMP仪器面板和LAMP软件展示检测结果。

在此LAMP实验中，样本S1至S6为鼠伤寒沙门氏菌印芬蒂斯血清型ATCC 51741的十倍系列稀释液，浓度范围为每反应110万至11个菌落形成单位。阳性对照（PC）为每反应17,000个菌落形成单位的鼠伤寒沙门氏菌伤寒血清型LT2，无模板对照（NTC）为分子级水。NTC孔在LAMP仪器面板上的Tmax为空白，退火温度约为81摄氏度，在LAMP软件中Tmax和退火温度均为空白。

阳性对照孔在两种平台上均显示Tmax为7分45秒，退火温度约为90摄氏度。样品S1至S6的Tmax介于6分30秒至12分15秒之间，退火温度均约为90摄氏度，均表明检测结果为阳性。LAMP反应效率很高，可产生大量DNA。

因此，采用最佳实验室规范以防止交叉污染至关重要。在制备DNA模板时也应采取类似的规范操作，因为受污染的动物饲料中的增菌样本可能含有较高水平的沙门氏菌。若动物饲料样品经LAMP检测呈阳性，应依照美国食品药品监督管理局（FDA）《细菌分析手册》中的程序，通过培养分离法进行确认。

阴性样本可直接报告为阴性。将此LAMP方法纳入美国食品药品监督管理局（FDA）《细菌学分析手册》为该快速、稳健且操作简便的技术在食品安全检测中的更广泛应用铺平了道路。