表观遗传重编程作为从成体皮肤成纤维细胞获取胰岛素分泌细胞的一种安全简便方法

本实验的总体目标是将成纤维细胞转化为可分泌胰岛素的细胞，同时不诱导多能性，也不使用逆转录病毒载体。该方法有助于解答再生医学领域，尤其是糖尿病细胞治疗中的关键科学问题。该技术的主要优势在于，我们能够在不诱导细胞产生稳定的多能状态且不依赖逆转录病毒载体的情况下，实现细胞表型的转变。

演示该实验步骤的是本实验室的博士后 Georgia Pennarossa。开始操作时，向35毫米的培养皿中加入1.5毫升无菌的0.1%猪源明胶，室温下孵育2小时以完成包被。接着，用含有2%抗生素-抗真菌溶液的PBS冲洗人皮肤活检组织。

随后，将活检组织置于100毫米的培养皿中，用无菌手术刀将其切成约2立方毫米大小的组织块。然后，将5至6个皮肤组织块放入预先包被的35毫米培养皿中。在每个组织块上滴加一滴成纤维细胞培养基，并在37°C、5% CO₂条件下进行培养。

孵育六天后，小心弃去组织碎片。成纤维细胞应开始从组织碎片中生长出来，并逐渐形成单层细胞。在此步骤中，将成纤维细胞在37°C、5% CO₂条件下培养至80%汇合度。

然后将细胞接种至新的培养皿中，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养，传代比例根据细胞生长速度保持在1:2至1:4之间。接着，在细胞培养皿中加入0.1%猪源明胶，室温孵育2小时以完成包被。

在接种成纤维细胞前10至30分钟，去除多余的包被液。随后，从培养皿中移除成纤维细胞培养基。用添加了1%抗生素-抗真菌溶液的PBS洗涤细胞三次。

然后，加入一层薄薄的胰蛋白酶-EDTA溶液。在37摄氏度下孵育，直至细胞单层开始从组织培养皿底部脱落且细胞发生解离。随后，用九份成纤维细胞培养基稀释细胞悬液，以中和胰蛋白酶的消化作用。

然后，在室温下使用血细胞计数板在显微镜下对细胞进行计数。计算所需成纤维细胞培养基的体积，以重悬细胞并获得每平方厘米7.8 × 10⁴个成纤维细胞的细胞浓度。随后，将细胞悬液在室温下以150 × g离心5分钟。

然后，移除上清液，并用计算好的体积的成纤维细胞培养基重悬细胞。随后，将细胞接种至经0.1%明胶预包被的培养皿中，在37°C、5%二氧化碳条件下培养24小时。在第0天使用前，立即通过将2.44毫克5-aza-CR溶解于10毫升高糖DMEM培养基中，配制5-aza-CR储存液。

通过过滤灭菌。接着，将1微升5-aza-CR储存液稀释至1毫升成纤维细胞培养基中。为提高细胞可塑性，在细胞接种后24小时，移除接种的成纤维细胞的培养基。

加入1 µM的5-aza-CR储存液，在37°C、5%二氧化碳条件下培养18小时。第1天，配制新鲜的HP培养基。经1 µM 5-aza-CR孵育后，移除培养基，用HP培养基清洗细胞3次，以确保完全去除5-aza-CR。

然后，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下，用HP培养基孵育经5-aza-CR处理的成纤维细胞3小时。为监测5-aza-CR处理的效率，观察是否存在任何形态学变化。细胞应失去成纤维细胞典型的细长形态，转变为更小的圆形或椭圆形，并伴有细胞核增大。

在第1至第6天，配制胰腺基础培养基和Activin A储备液。随后，将经5-aza-CR处理的成纤维细胞接种于添加了Activin A储备液的胰腺基础培养基中，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养6天，每天更换培养基。在第7至第8天，通过将16.6毫升DMSO加入50毫克视黄酸中，配制视黄酸储备液。

将细胞在添加了Activin A储备液和视黄酸储备液的胰腺基础培养基中培养两天，37摄氏度、5%二氧化碳条件下，每天更换培养基。第9天至第36天，将细胞在添加了ITS、B27和BFGS储备液的胰腺基础培养基中培养，前15天每天更换培养基，从第16天起每隔一天更换一次培养基。细胞培养条件为37摄氏度、5%二氧化碳。

该图展示了内分泌胰腺分化过程中发生的形态学变化。在诱导七天后，人类细胞逐渐聚集成簇。在添加视黄酸后，细胞重排为网状结构，并聚集成可区分的细胞团。

随着时间的推移，这些结构逐渐发展，招募细胞并聚集成扩大的三维细胞集落。最终，细胞集落形成球形结构，倾向于从培养表面脱离并在培养基中自由漂浮，类似于体外培养的典型胰腺胰岛。经过36天的胰腺诱导后，人表观遗传转化细胞的全基因组DNA甲基化水平恢复至未经处理的成纤维细胞所观察到的水平。

在转化过程结束时，可观察到PDX1与CPEP的共定位，而这些内分泌胰腺标志物在未经处理的成纤维细胞中则完全缺失。该图表显示了表观遗传转化细胞在暴露于20毫摩尔D-葡萄糖和20毫摩尔L-葡萄糖后胰岛素的释放量。一旦掌握，该技术若操作得当，可在38天内完成。

该研究一经发展，便为再生医学领域的研究人员探索糖尿病的细胞治疗应用于人体铺平了道路。观看本视频后，您应能充分理解如何将成纤维细胞转化为胰岛素分泌细胞，且不诱导多能性，也不使用逆转录病毒载体。