基于人血小板的LC-MS分析作为研究线粒体代谢的平台
2016年4月4日
此处我们展示分离的人类血小板可作为一种便捷的 离体 用于研究对复合体 I 抑制剂鱼藤酮的代谢适应性的模型。该方法采用同位素示踪结合液相色谱-质谱法进行相对定量，可适用于多种研究设计。
本实验的总体目标是确定外源性物质处理或疾病状态如何改变细胞代谢。该方法有望揭示疾病状态或施加的毒素如何影响细胞代谢。一旦明确这一点，本方法就能够揭示某种干预措施是否可以纠正该缺陷。
该技术的主要优势在于不依赖转化的细胞系，因此更有可能提供与人类健康直接相关的结果。开始此操作前，用二甲基亚砜配制10毫摩尔的鱼藤酮储备液。对10毫摩尔的鱼藤酮储备液进行系列稀释，得到鱼藤酮浓度范围为1纳摩尔至100微摩尔的溶液。
接下来，将每种储备液各50微升加入到5毫升预先配制的富集型Tyrode缓冲液中，以制备雷公藤内酯浓度范围为10皮摩尔至1微摩尔的溶液。向其中一份缓冲液样品中加入50微升DMSO，作为溶剂对照。为从全血中分离血小板，将全血样品在175 × g条件下离心15分钟，离心过程中不设刹车。
完成后，将上层富血小板血浆层中的1毫升转移至1.5毫升微量离心管中。转移富血小板血浆时，注意不要扰动白细胞层，以免淋巴细胞污染血小板沉淀。以400 × g离心富血小板血浆层5分钟。
然后，吸除上清液。每种条件使用不少于三个生物学重复，将血小板沉淀重悬于1 mL预先配制好的鱼藤酮溶液中。随后，将重悬的血小板置于水套式二氧化碳培养箱中，在37 °C、5%二氧化碳、95%湿度条件下孵育1小时。
此时，将样品在3000 × g离心3分钟，使血小板沉淀。吸除上清液后，加入适当量的稳定同位素标记内标物。随后，将血小板重悬于750 µL预冷的10%三氯乙酸中。
每个样品脉冲超声处理30次，每次0.5秒。离心后，将C18固相萃取柱连接至真空 manifold。用一毫升甲醇对萃取柱进行活化。
然后，用一毫升双蒸水平衡层析柱。将样品得到的上清液通过层析柱。完成后，用一毫升水洗涤层析柱。
接下来，将10毫升玻璃离心管放入真空 manifold 中，用于收集洗脱组分。用1毫升25毫摩尔的醋酸铵和甲醇洗脱层析柱。在氮气下干燥洗脱液后，将干燥残留物重新悬浮于50微升5%的5-磺基水杨酸中，并将样品转移至HPLC样品瓶中进行分析。
如先前在SH-SY5Y细胞中所报道，乙酰辅酶A硫酯相对水平在鱼藤酮作用下的变化被认为是由复合体I的抑制所导致。具体而言，琥珀酰辅酶A呈剂量依赖性减少，同时β-羟基丁酰辅酶A增加，而乙酰辅酶A水平保持不变。对经鱼藤酮处理的人血小板进行分析，结果高度一致，提供了一组独特的实验数据。
需要注意的是，由于血小板缺乏细胞核，这一观察结果凸显了该反应对线粒体的依赖性。在完成此操作后，可进一步开展其他方法，例如代谢示踪，以回答更多问题，如：该处理或疾病状态如何影响底物的利用？如果我们发现某些代谢物水平发生变化，其变化原因是什么？
该通路中哪些步骤受到影响，以及受影响的方式是什么？观看本视频后，您应能够充分理解如何从全血中分离血小板、进行受控的离体刺激，以及提取乙酰辅酶A硫酯用于LCMS分析。
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概述
本研究展示了使用分离的人类血小板作为离体模型，以研究在复合体I抑制剂鱼藤酮作用下发生的代谢适应。该方法采用同位素示踪结合液相色谱-质谱法进行相对定量，适用于多种研究设计。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞代谢
- 药理学
- 对人体健康的意义
背景
- 了解异源物质如何影响细胞代谢至关重要。
- 与转化细胞系相比，分离的人血小板提供了更相关的研究模型。
- 该方法有助于识别代谢缺陷的潜在干预措施。
- 鱼藤酮作为复合体 I 抑制剂，用于研究代谢变化。
研究目的
- 确定外源性物质处理对细胞代谢的影响。
- 探究疾病状态如何改变代谢过程。
- 评估干预措施纠正代谢缺陷的潜力。
使用的方法
- 用二甲基亚砜配制10毫摩尔/升的鱼藤酮储备液。
- 对鱼藤酮储备液进行系列稀释以获得不同浓度。
- 用于代谢分析的同位素示踪。
- 采用液相色谱-质谱法进行定量分析。
主要结果
- 分离的血小板可有效模拟对鱼藤酮的代谢反应。
- 同位素示踪揭示了显著的代谢适应性变化。
- 液相色谱-质谱联用技术可实现精确的定量分析。
- 该方法适用于多种实验设计。
结论
- 分离的人血小板是研究代谢的有价值模型。
- 该方法可为疾病机制及潜在治疗方法提供见解。
- 未来的研究可在此方法基础上进一步探索其他代谢通路。
常见问题
行业重要性概述
人血小板为研究线粒体代谢和异源物质效应提供了一种具有临床相关性的非转化模型，弥补了癌细胞系在代谢研究中的局限性。该平台可实现对代谢通路改变的可重复、供体特异性分析，支持早期发现阶段的靶点验证和机制性风险评估。通过血库来源实现的可扩展性，有助于从基础发现到临床前及临床研究的转化连续性。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过检测线粒体对复合体 I 抑制剂（如鱼藤酮）的反应，能够验证治疗假设。
- 操作价值：提供一种与人类相关的实验系统，减少了转化细胞系中代谢重编程带来的混杂因素。
- 预测价值：通过稳定检测代偿性代谢变化（例如糖酵解抑制后脂肪酸氧化增强），支持生物学层面的风险评估。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：生成酰基辅酶A硫酯的定量LC-MS读数，实现相对定量和同位素标记，用于评估特定代谢通路的活性。
- 操作价值：在生物学重复样本中提供可重复的代谢物谱型，支持外源物质筛选实验的检测标准化。
- 可扩展性：可从个体供体或血库分离血小板，从而规模化制备具有代谢活性的样本，用于高内涵筛选。
转化与临床前研究
- 转化连续性：将离体血小板反应与体内代谢适应相联系，支持基于生物标志物的临床前验证。
- 机制性风险降低：通过无核血小板的反应证据，阐明所观察到的代谢变化是否依赖于线粒体。
- 风险校正的推进：能够评估干预措施在逆转代谢缺陷方面的有效性，为先导化合物优化中的推进/终止决策提供依据。
流程与工作流整合
该方法适用于从靶点验证到先导化合物筛选直至临床前评价的整个发现流程，尤其适用于靶向线粒体的化合物及代谢调节剂的研究。
- 发现生物学：通过分离血小板对剂量依赖性鱼藤酮处理的响应，支持对外源性物质对细胞代谢影响的假设验证。
- 筛选：实现血小板的预处理以适用于液相色谱-质谱（LC-MS）分析，为化合物文库筛选提供可重复的定量结果。
- 分析：提供乙酰辅酶A、琥珀酰辅酶A和β-羟基丁酰辅酶A硫酯的相对定量，从而实现不同条件下代谢通量的比较。
- 转化研究：通过模拟与疾病状态及治疗干预相关的代谢适应，与临床前研究的连续性保持一致。
- 企业级复用：建立标准化的血小板分离与代谢物提取流程，适用于多个项目及治疗领域的研究。
运营与企业影响
- 科学价值：采用具有生理相关性的人源模型，避免癌细胞系带来的实验假象，从而提高靶点验证的预测可信度。
- 操作价值：通过标准化的血小板分离、离体刺激及代谢物提取流程，确保实验的可重复性。
- 战略价值：通过早期发现化合物的代谢缺陷，减少因未预见的线粒体毒性导致的后期研发失败，提升资本使用效率。
- 项目组合影响：基于化合物对人源系统中核心代谢通路的影响，支持依据风险调整的化合物优先排序。
实施注意事项
- 需要具备血小板分离、无菌细胞操作以及液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）代谢组学方面的专业知识。
- 依赖于离心设备、固相萃取用真空装置以及高效液相色谱-质谱（HPLC-MS）系统的可用性。
- 需要在不同实验室和供体之间对富血小板血浆的制备和鱼藤酮给药进行标准化。
- 针对不同的外源性物质及同位素标记方案，需考虑方法的适应性调整。
- 受限于血小板在体外的存活能力，以及分离后需立即处理以维持其代谢完整性的要求。
