生物能量学与氧化爆发：人白细胞和血小板分离与评估的实验方案

在以下实验方案中，将展示人类血液单核细胞、淋巴细胞、中性粒细胞和血小板的生物能量谱及氧化爆发反应的测定方法。首先从新鲜抽取的血液中分离出血沉棕黄层和富血小板血浆组分；其次，通过密度梯度离心将异质性的白细胞群体分离为单个核细胞层和多形核细胞层。

接下来，通过最大分离法进一步分离出纯的单核细胞、中性粒细胞和淋巴细胞群体，然后将其接种用于细胞外通量或XF分析。最终，可利用XF技术测量单核细胞、淋巴细胞和血小板中线粒体功能的敏感性和可重复性，以及单核细胞和中性粒细胞耗氧率的氧化爆发。我们今天将向您展示的这项技术的优势在于，仅需少量血液样本，即可制备出患者血液中所有主要类型的细胞。

这些是处于纯化灭活形式的血小板和白细胞，可用来检测其线粒体功能。我们认为，这能够实时反映患者体内多种疾病状态和生理状况。该方法有助于回答有关代谢的关键问题，例如生活方式、饮食以及病理应激对线粒体功能的影响。

本方案结合了多种技术，用于分离和测定不同白细胞群体及血小板中的细胞生物能量学参数。该方案的这一步骤至关重要，因为密度梯度和磁性分离需要精确的移液操作。此外，在组分分离过程中，您需要清楚各细胞群体所在的位置。

我们将演示如何分离外周血细胞，并在24孔细胞外通量分析仪（XF 24）上分析细胞生物能量代谢。然而，该方法也可在XF 96上进行。至少在开始实验前两小时，使用XF水合溶液润湿XF传感器微孔板探针。

然后将 freshly drawn 的全血在具有摆动桶转子的离心机中，于室温下以 500 × g 离心 15 分钟。使用移液管去除上层富含血小板的血浆，保留红细胞与白膜层（buffy coat）之间约 1 厘米的血浆层，并将分离出的血浆在室温下留置，以备后续处理。随后，将白膜层转移至无菌的 50 毫升锥形管中，并将白细胞稀释至 24 毫升。

接下来，在基础RPMI培养基中，向三个15毫升锥形管中各加入3毫升低密度、不透明的1.077溶液。然后将一支5毫升细口吸头插入每个管的底部，依次缓慢释放3毫升高密度、不透明的1.119溶液。

现在，使用设置在低功率档的自动移液器，小心地向每层密度梯度中加入 8 mL 稀释后的血液，注意不要扰动各层。为便于观察各梯度层，已在低密度梯度中加入蓝色染料。离心分离细胞后，用无菌玻璃移液管收集单个核细胞和多形核细胞，注意不要干扰其他细胞层。

将每根试管中的单个核细胞和多形核细胞群体分别收集到对应细胞类型的无菌50毫升锥形管中，并向两根试管中各加入四倍体积的RPMI培养基。离心后，将细胞沉淀转移至1.5毫升离心管中，再次离心，然后用80微升添加了BSA的新鲜RPMI重悬。随后，分别向单个核细胞和多形核细胞组分中加入20微升磁珠标记的抗CD14和抗CD15抗体。

将每种细胞悬液在4°C下孵育15分钟，然后用1毫升RPMI-BSA培养基洗涤各管，并将沉淀重悬于500微升RPMI-BSA中。随后将细胞悬液分别加入经RPMI-BSA洗涤过的LS柱中，并用3毫升RPMI-BSA培养基洗涤每根柱子3次。将细胞悬液的穿流液及柱洗液收集至无菌管中以分离单核细胞和中性粒细胞；最后一次洗涤后，将柱子移出磁场，并用5毫升RPMI-BSA洗脱正向选择的细胞至无菌管中。为分离淋巴细胞，将细胞柱穿流液的洗脱组分离心沉淀，将细胞沉淀重悬于80微升RPMI-BSA中，并加入20微升CD61和CD235A抗体，在4°C下孵育15分钟。

然后重复之前的最大分离步骤，收集含有淋巴细胞的流穿液以分离血小板，进行离心，并保留富含血小板的血浆，随后去除血浆，用5毫升无菌PBS缓冲液（添加1微克/毫升前列腺素I₂）洗涤细胞沉淀一次，再将血小板沉淀重悬于1毫升新鲜的PBS-前列腺素I₂缓冲液中。接着接种已分离的单核细胞、淋巴细胞、中性粒细胞和血小板。首先对细胞进行计数，并用XF检测试剂将细胞调整至适当体积，使每孔接种密度为2.5 × 10⁵个细胞，接种体积为200微升。在24孔XF细胞培养微孔板（预先用Cell-T对血小板进行包被）中，每孔接种2.5 × 10⁷个细胞，体积为200微升。

将细胞离心至培养板后，用XF培养基将每孔终体积补至660微升，并在XF检测前于37摄氏度孵育30分钟。在孵育期间，按列表顺序将75微升检测试剂加入XF传感器微孔板的加样孔中。若需获取氧化爆发数据，可在抗霉素A之后注入PMA，将其置于后续的注射孔位置。将微孔板放置于细胞外通量分析仪上以开始检测。可使用Seahorse XF细胞外通量分析仪测定白细胞和血小板的生物能量谱，该仪器能够以非侵入方式实时测量细胞的耗氧量。

每种细胞类型均以五次重复接种于XF 24微孔板中，如上表所示。图中按细胞类型展示了实验过程中测得的代表性基础呼吸和氧化爆发值，以及每孔的平均蛋白浓度。耗氧速率值经对应孔中的总蛋白含量标准化后，以每分钟每微克蛋白的皮摩尔数（pmol/min/µg蛋白）表示。基础耗氧速率由前三个测量值确定。

寡霉素（oligomycin）是一种线粒体ATP合酶抑制剂，将其注入XF培养基中，可用来评估与ATP合成相偶联的耗氧速率，该速率表示为ATP偶联耗氧率；而残余耗氧速率减去非线粒体耗氧速率的部分，则可归因于质子漏。加入解偶联剂FCCP后，可测定最大耗氧速率，随后注入抗霉素A（antimycin A）——一种线粒体呼吸抑制剂，以测定非线粒体来源的耗氧。储备容量用于衡量线粒体在能量需求增加时所能承担的额外做功能力，可通过最大呼吸速率与基础呼吸速率之差进行计算，从而确定单核细胞和中性粒细胞的氧化爆发能力。

注射P-M-A-A-P-K-C激动剂后，氧消耗速率的增加与N-A-D-P-H氧化酶介导的氧化剂产生相关。一旦掌握该技术，从采血到完成操作可在短短三小时内完成（不包括检测本身所需时间），前提是操作得当。在实施该步骤时，重要的是在生物安全柜中进行每一步操作，并使用无菌的室温缓冲液和培养基，以维持无菌条件。完成该步骤后，可进一步开展其他实验方案，例如流式细胞分析，以测定细胞纯度、白细胞的活化状态，以及白细胞亚群的细胞生物能量状态。

观看本视频后，您现在应该对如何制备血小板、淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞，并将其放入Seahorse仪器中测量氧化爆发和线粒体功能有了较为清晰的认识。随后，您可以分析您的患者群体，确定其生物能量学在实时条件下的变化情况。请务必注意，处理人类患者样本可能具有极高的危险性。

因此，您在进行此操作时需要佩戴个人防护装备，并使用生物安全柜。