利用rx3:GFP转基因斑马鱼通过光片显微镜观察眼部形态发生过程

本方案在正常和病理条件下，均可提供关于眼球形态发生过程的可视化和实时信息。本方案能够快速获取z轴堆叠图像，从而减少数据集中每幅三维图像之间的时间间隔，进而提高对眼球形态发生过程的时间分辨率。

由于胚胎在单体节阶段呈球形，将其在毛细管中定位可能具有挑战性，因此需要将多个胚胎装入毛细管中，以确保至少有一个胚胎处于正确方向。为在受精后10小时筛查体节的存在，将胚胎置于体视显微镜下，并使用荧光适配器确认rx3:GFP转基因的存在。一旦鉴定出3至5个GFP阳性的单体节胚胎，即使用精细镊子去除胚胎的卵膜。

为了将胚胎包埋在琼脂糖中，将胚胎转移至含有500微升E3胚胎缓冲液的微量离心管中，该缓冲液中添加了168微克/毫升的三卡因，并加入500微升冷却但仍为液态的2%低熔点琼脂糖与E3缓冲液的混合液，轻轻混匀。使用带有PTFE推杆的1毫米玻璃毛细管，将包埋有琼脂糖的胚胎吸入毛细管中，在室温下静置30至60秒，使琼脂糖凝固。然后将毛细管放入盛有添加三卡因的E3缓冲液的烧杯中。

为建立用于胚胎成像的光片显微镜系统，将毛细管插入毛细管样品架中，并将金属套管卡入样品架金属圆盘中心。将两个橡胶塞插入套管中，使切口朝向套管两端，并将毛细管穿过两个橡胶塞的中间。当标记到达金属套管底部时，使用金属盖帽固定毛细管，并将样品架放置在显微镜顶部，使白色标记对齐。

关闭样品架的盖子，然后在显微镜软件界面中点击定位毛细管按钮。使用Ergo Drive控制面板，将毛细管移至物镜正上方。打开盖子后，轻轻推动推杆，直至含有胚胎的琼脂糖部分悬垂于毛细管底端前方，并位于物镜前方。

关闭定位毛细管，点击定位样品，将视图从样品室网络摄像头切换至显微镜物镜，并使用此视图更精确地调整样品位置。然后关闭定位样品功能，切换至采集选项卡。勾选z轴层扫和时间序列选项。

在采集模式参数窗口中，选择双侧光片设置，并勾选在线双侧融合和摆动扫描选项。点击连续采集以获得胚胎的实时图像。在通道窗口中，选择 488 通道，并将激光功率设置为 1，曝光时间为 7.5 毫秒。

使用 Ergo Drive 控制面板调整胚胎位置，使眼区正对相机，并在通道参数中调节左右光片，直至眼区充分聚焦。将第一和最后一个 z 轴位置设置在可检测到荧光信号的范围之外约 500 微米处，然后单击“最优”以将步长设为 0.477 微米。设置孵育参数时，勾选帕尔帖装置的选项框，以保持 28 摄氏度的温度。

在时间序列窗口中，选择适当的实验频率和时间间隔以采集图像。单击“开始实验”。选择用于保存图像集的文件夹并设置图像前缀，然后单击“保存”以开始成像。

进行图像分析时，将图像文件导入合适的4D图像分析软件程序，点击4D查看器立方体、比例尺和视频图标以打开故事板任务栏。选择添加关键帧序列，并以秒为单位指定视频的持续时间。取消勾选创建旋转框，勾选使用时间进程，以在视频中包含特定的时间点。

保存故事板，以便将相同的参数应用于多个图像集。单击“导出视频”以保存延时成像的视频，并指定视频导出设置，包括文件名和保存位置、视频格式、视频分辨率、帧率、数据分辨率。如需可添加时间戳，然后选择录制。

若要在特定时间点创建旋转视频，请按上述方法添加关键帧序列，但需勾选“创建旋转”选项，同时取消勾选“使用时间进程”选项。如需在任意方向和任意单个时间点渲染高分辨率图像，请在4D查看器中选择相机图标。要构建分析流程，请选择烧瓶图标以进入分析面板，并打开分析操作菜单，选择所需的分析操作序列。

单击蓝色三角形以启动分析流程。运行结束后，在弹出窗口中单击特征列，查看可提供有关目标对象信息的特征列表，然后单击“导出”将数据导出至电子表格。在此代表性分析中，从体节形成阶段到受精后24小时，每隔五分钟从背侧视角对一个转基因 rx3:GFP 胚胎进行成像，共计14小时。

如所观察到的，对本次分析中获取的图像进行流程化处理，有助于生成发育中眼睛的掩膜。需要注意的是，当眼区分离为两个视泡时，可在前脑中观察到第三个表达rx3:GFP的区域，该区域参与下丘脑的形成。该信息同样可在体积数据中观察到，并且由于其体积明显小于任一视泡，因此可轻松地将该区域的数据与视泡数据区分开来。

此操作可进一步结合其他分析，例如，在图像数据集中追踪单个细胞。