一种的开发 体外 评估经历上皮-间充质转化的间充质细胞收缩功能的实验方法

本实验的总体目标是评估经历体外炎症细胞因子诱导的上皮-间充质转化（EMT）后间充质细胞的收缩能力。这种间充质表型是EMT后细胞基本功能的一种改变，常见于由炎症免疫反应引发的疾病过程，例如特发性肺纤维化或重症哮喘中的气道重塑。该技术的主要优势在于无需特殊设备，且具有高信息含量。演示本实验操作的将是我实验室的研究生竹岛英幸（Hideyuki Takeshima）和牧田浩介（Kosuke Makita）。

首先用 5 至 10 毫升 PBS 洗涤 A-549 人肺上皮细胞培养物。接着，在 37 摄氏度、5% 二氧化碳条件下，用 2 毫升胰蛋白酶-EDTA 消化贴壁细胞。3 分钟后，将细胞悬液转移至含有细胞培养基的锥形管中，并在离心机中离心沉淀细胞。

将沉淀重悬于2 mL细胞培养基中，保留少量上清用于计数。随后，在10 cm的聚苯乙烯培养皿中，每皿加入10 mL培养基，接种0.5至1 × 10⁶个细胞，并将细胞培养物在培养箱中孵育24小时。为诱导EMT，次日用10 µL TGF beta 1和TNF alpha处理细胞，然后将培养板放回培养箱继续孵育48小时。

第四天，用 5 至 10 毫升 PBS 洗涤诱导的 EMT 培养物，然后用胰蛋白酶-EDTA 消化细胞，方法如前所述。接着，将 DMEM 中的细胞悬液（含胰蛋白酶抑制剂）离心，将沉淀重悬于 500 微升 PBS 中。随后计数细胞，并加入新鲜配制的凝胶培养基，使细胞密度达到每孔 3 × 10⁵ 个细胞，使用移液器在凝胶化前轻柔而迅速地混匀溶液。

迅速但小心地将 0.5 毫升细胞均匀地以圆柱形加入未经处理的 24 孔板的每个孔中。然后将该板放入细胞培养箱中孵育 15 分钟。当凝胶完全凝固后，用灭菌的刮铲沿每个凝胶的边缘单向环形移动，使凝胶与孔板脱离而不破坏凝胶结构。

取出凝胶时，注意不要在孔中来回移动刮铲。然后用刮铲轻轻将凝胶转移至含有5毫升DMEM的单个16毫米组织培养皿中，DMEM中添加1% FBS，并根据需要加入TGF beta 1和TNF alpha。最后，轻轻摇动培养皿，确保凝胶漂浮在培养基中，然后将凝胶放回细胞培养箱中。

未经处理的A541细胞呈现类似铺路石状和三角形的形态，这是上皮细胞的典型特征。然而，在用TGF-β1和TNF-α刺激后，这些细胞表现出细长的梭形形态，类似于间充质细胞的形态。对EMT前后上皮和间充质标志物表达进行qRT-PCR分析显示，经炎症性细胞因子处理48小时的A541细胞中，CDH1的表达显著降低，而VIM和ACTA2的表达显著升高。

此外，通过蛋白质印迹分析确定，用这些细胞因子刺激会减弱E-钙黏蛋白的表达，而波形蛋白、N-钙黏蛋白以及α-平滑肌肌动蛋白的表达则被诱导。在凝胶收缩实验中，48小时后，含有经TGF-β1和TNF-α处理细胞的凝胶比含有经PBS处理细胞的对照凝胶更小。事实上，72小时后，与对照凝胶相比，含有细胞因子处理细胞的凝胶体积显著缩小，该结果通过凝胶分析仪测定。

如观察所示，如果操作得当，凝胶收缩步骤可在三小时内完成。在进行该实验时，重要的是要记住，在执行凝胶收缩实验之前，必须确认上皮-间质转化（EMT）已成功诱导。经过观察，该技术为研究在炎症状态下（如纤维化或肺组织重塑）EMT过程的变化提供了一种方法。

观看本视频后，您应能充分理解如何将发生上皮-间质转化（EMT）的细胞接种到某种培养板中，并在培养基中使其悬浮培养。