依次施加玻璃盖玻片评估小鼠晶状体压缩刚度：应变与形态测量分析

本实验的总体目标是采用一种简单且低成本的方法，评估小鼠晶状体的压缩刚度和几何形态。该方法可解答晶状体研究领域中的一些关键问题，例如不同遗传因素和实验干预如何影响晶状体的生物力学特性。

该技术的主要优势在于其精确、可重复，且无需昂贵或专用设备。该方法可揭示小鼠晶状体的特性，未来有望应用于大鼠和兔子等体型较大的模式生物。由于晶状体解剖和盖玻片应用步骤若无演示则难以掌握，因此对该方法的可视化呈现至关重要。

本实验操作将由我实验室的博士后研究人员 Catherine Cheng 示范。开始解剖时，使用弯头镊子压住已实施安乐死的小鼠眼球周围的组织，使眼球突出眼窝。随后，摘除眼球并将其置于含有新鲜 PBS 的解剖皿中，在解剖显微镜下进行后续操作。

尽可能靠近眼球处剪断视神经。然后通过视神经穿出眼球后部的孔洞，用精细的直镊子轻柔且小心地插入眼球内部。使用剪刀从眼球后部向角膜边缘小心地做切口，注意不要损伤晶状体。

沿着角膜与巩膜之间的连接处继续切开，至少环绕眼球一半以上。然后轻轻按压角膜，通过切口将晶状体从眼中推出。接着，使用尖头直镊子小心地移除仍附着在晶状体上的任何较大碎屑。

并通过目视确认镜头无损伤。在开始测量硬度前至少两小时，使用分析天平称量来自同一盒的至少10片盖玻片，计算盖玻片的平均重量。

然后，用室温的磷酸盐缓冲液（PBS）预先润湿盖玻片和直角镜。在材料水化的同时，向测量室中加入 65 至 75 毫升 PBS。将测量室置于解剖显微镜下，显微镜设置为 30 X 放大倍数，光源来自底部，并在左右两侧使用光纤光源照明。

当盖玻片准备就绪后，将直角反射镜以固定距离放入腔室中，该距离相对于用于固定晶状体的凹槽保持恒定。接着，使用弯头镊子小心地将解剖好的晶状体转移至测量腔室。将光源的光功率调节至最大光强的80%，并根据环境光照、用户偏好以及图像质量需要，相应调整电源输出。

从培养室正上方获取未加载镜片的俯视图像。然后，拍摄镜面边缘处于焦点状态的图像，接着通过凹槽外的镜面拍摄未加载镜片的侧视图。随后，将一枚镜片放入凹槽中，并确认镜片已牢固且笔直地嵌入其前极或后极的凹槽内。

在镜中拍摄镜头的照片。然后，轻轻地将盖玻片放置在镜头上。两分钟后，拍摄载入后的镜头另一张侧视图像。

继续添加盖玻片，每次添加后两分钟获取侧面图像，直至总共添加10片盖玻片。然后移除所有盖玻片，等待最后两分钟，获取凹槽内外晶状体的侧面图像，以及凹槽外晶状体的顶视图像。

为了确定晶状体核的大小，将晶状体放入盛有磷酸盐缓冲液（PBS）的洁净培养皿中，使用精细的直头镊子轻轻去除晶状体囊膜。通过戴手套的手指轻轻滚动晶状体以去除皮质纤维细胞。接着，用PBS轻轻冲洗晶状体核，并将晶状体核重新放回测量室中。

通过直角镜获取晶状体核的图像。最后，使用合适的图像分析软件测量每次加载步骤前后晶状体的赤道直径和轴向直径，并测量每个晶状体核的直径。

在此代表性实验中，测量了两个月、四个月和八个月大小鼠晶状体的硬度和尺寸，并计算了轴向和赤道向应变。轴向应变为施加载荷的对数函数，在最大施加载荷下，轴向和赤道向应变均随年龄增长呈现具有统计学意义的显著下降，表明小鼠晶状体的硬度随年龄增加而增大。实验过程中采集的图像数据还被用于确定其他多种晶状体形态学特征。

与预期一致，晶状体的轴向和赤道直径以及晶状体体积均随年龄增长而增加。长宽比表明，晶状体的赤道直径略大于轴向直径。该参数不随年龄变化。

晶状体核的直径、体积和占比随年龄增长而增加，表明晶状体核在老化过程中会发生重塑，相对尺寸逐渐增大。一旦掌握该技术，若操作得当，每枚晶状体的处理可在30至45分钟内完成。在进行此操作时，重要的是将晶状体均匀地置于凹槽内，并在每次添加新的盖玻片之间让晶状体静置松弛两分钟。

观看本视频后，您应能够充分理解如何通过依次使用盖玻片来评估小鼠晶状体的压缩刚度及形态测量学参数。这种精确、简便且成本低廉的技术为晶状体研究人员探索基因突变在小鼠中产生的生物力学效应提供了有效途径。