整体成像技术用于可视化及量化外周晶状体结构、细胞形态与排列组织

我们的目标是确定建立复杂晶状体结构的分子机制，以及这种已建立的结构如何调控晶状体在透明度和形状变化方面的功能。为了推动本领域的研究进展，我们采用新的成像方法，能够以高空间分辨率可视化晶状体特征，从而实现对晶状体结构和细胞特征进行定量图像分析。与组织切片观察或平铺封片方法相比，整体晶状体成像具有优势，因为它能够保持完整的三维组织结构。

这使得我们能够对天然晶状体结构进行深入的形态计量学检查与定量分析。晶状体是一种具有特殊功能的整合性生物组织，其功能依赖于细胞及其相关结构在空间上的定位以及随深度变化的几何特征。采用本视频所展示的成像方案与定量方法，将有助于更深入地理解晶状体结构及其复杂组织构型的形成机制。

开始实验前，需在琼脂糖中制备用于固定的凹槽。具体操作如下：将2%琼脂糖溶于PBS中，使用微波炉加热并混匀，直至溶液完全液化。随后，用移液器将250微升液化琼脂糖转移至玻璃底培养皿中。

使用柔性塑料盖玻片将琼脂糖在培养皿上压平。待琼脂糖冷却并完全凝固后，用精细尖头镊子移除盖玻片。然后使用3毫米活检打孔器，在培养皿中心的琼脂糖上打一个孔。

借助精细操作拭子去除多余的琼脂糖。将琼脂糖模具保存在磷酸盐缓冲液（PBS）中，并于4°C条件下冷藏备用。在安装分离的Mirion物镜之前，根据物镜类型向制备好的琼脂糖模具中加入2毫升适当的培养基。

使用胚胎镊子，将固定保存的活体晶状体轻柔地转移至琼脂糖的凹槽中。然后将培养皿置于倒置显微镜载物台上。通过观察细胞核染色情况，确认晶状体的前部区域朝向物镜。

若未观察到细胞核，使用弯头镊子轻轻将晶状体旋转约180度，使前部朝向物镜。接着，使用共聚焦显微镜进行成像。为观察晶状体囊膜，采用40倍物镜以0.3微米的步长采集Z轴层扫图像。

在WGA染色所指示的晶状体囊膜表面之前获取第一张图像，并在上皮细胞顶面之后获取最后一张图像。为观察上皮细胞，使用63倍物镜以0.3微米的步长采集Z轴层扫图像。通过制备固定晶状体的固定琼脂糖楔形块，开始整体装片的制备。

为此，取一个玻璃底培养皿，倒入约五到六毫升熔融的2%琼脂糖（溶于PBS中）。等待琼脂糖凝固。然后使用锋利的刀片在凝固的琼脂糖中切出一个三角形凹槽。

移除琼脂糖楔块，并向培养皿中加入一毫升磷酸盐缓冲液（PBS）。切割后，吸除残留的任何琼脂糖。如需放置多个镜片，可在同一培养皿中制备多个楔块。

保存模具时，先向其中加入 1 毫升 PBS，然后于 4 摄氏度保存。使用弯头镊子将晶状体放入含有 1 毫升 PBS 的琼脂糖楔形槽中。调整晶状体方向，使其赤道区域朝下，当置于共聚焦物镜上方时，正对显微镜玻片。

将培养皿置于显微镜载物台上。为确认赤道区域处于焦点，需观察细胞核，确保其排列成行。同时检查排列不规则且形状不一的赤道上皮细胞，以及由细胞膜处的效应和染色所指示的、排列精确且呈六边形的子午线行细胞。

视野中细胞核呈随机排列，表明晶状体的前部正对物镜。若无法观察到细胞核，则很可能晶状体的后部正对物镜。在此情况下，应使用弯头镊子旋转晶状体，直至观察到晶状体赤道区排列整齐的细胞核。