生物样本制备与测定晶状体悬韧带纤维黏弹性特性的力学技术

本方法的重要性在于能够回答以下问题：悬韧带纤维（即眼内晶状体的悬吊纤维）的黏弹性特性是什么？本技术的主要优势在于，能够定量分析来自经基因靶向修饰与未经修饰小鼠的微小而精细的悬韧带纤维的黏弹性特性。编码微原纤维蛋白的基因发生突变，是多种遗传性综合征性疾病的病因基础。

利用我们的技术，可以研究特定突变如何改变微原纤维的生物力学特性。首先，在小鼠安乐死后，使用精细镊子摘除眼球。将固定针的尖端穿过眼球壁，并置于玻璃体中央，注意避免损伤晶状体。

小心地将穿刺的眼球转移至含有4%多聚甲醛和磷酸盐缓冲液的试管中。打开连接针头的阀门，使其与位于样本上方25厘米处的固定液储液罐相通，以维持眼内15至20毫米汞柱的正压，并在固定期间保持该压力，使样本过夜固定。次日，取出固定针头，并用磷酸盐缓冲液清洗眼球10分钟。

使用眼科手术剪和体视显微镜，在靠近视神经乳头处的眼壁上做一个全层切口。将切口向前延伸至赤道部，然后沿眼球赤道周缘环形剪开，同时小心避免损伤纤细的睫状突及其相关的悬韧带纤维。通过移除眼球后部组织，暴露晶状体的后表面。

用镊子将解剖好的眼球从缓冲液中取出，放置在干燥的擦拭纸上，使角膜面朝下。轻轻在擦拭纸表面拖动角膜以吸干液体。在50毫米培养皿底部滴一滴瞬干胶，将平台固定于其上。

将培养皿放置在体视显微镜的载物台上，使含有胶水的孔位于视野中。向培养皿平台孔中加入三微升（3 µL）瞬干胶，以固定眼球。小心将眼球放入孔中，并迅速调整，使晶状体的背面朝上。

用干燥擦拭布的角落轻轻按压镜片暴露面以使其干燥。为测量悬韧带的黏弹性响应，打开天平，将培养皿置于天平上，然后启动天平记录程序和相机软件。打开伺服电机控制器。

在计算机上启动控制器应用程序，并以 50 微米为增量设置运动参数。将毛细管杆弯曲成 90 度。将弯曲的毛细管插入毛细管探头架中，并拧紧固定螺钉。

在毛细管尖端添加一滴紫外光固化胶。使用操纵器上的手动调节装置移动毛细管探针的尖端，将其精确置于透镜顶部正上方。通过正面目视观察以及显微镜相机的侧视图像，检查紫外胶的底部是否位于透镜顶部的中心位置。

通过相机观察，降低探针尖端，直至紫外胶与透镜接触并覆盖其上表面的1/3至1/2。使用波长为380至400纳米、强度约为1毫瓦的近可见紫外光源定向照射，固化胶水。向培养皿中加入PBS溶液，直至液面深度至少覆盖眼球2毫米。

将柱面透镜放置在显微镜前方，并靠近培养皿但不接触。同时，启动计时器程序开始记录。使用相机拍摄眼睛和探针的图像。

60 秒后，开始进行 50 微米的位移。每隔 60 秒重复一次，直至实验完成，即所有悬韧带纤维断裂为止。运行结束后保存标度记录数据，并将其导出为兼容的电子表格格式。

同时，保存运行过程中获得的镜头图像。将数据导入电子表格。利用第一个和最后一个刻度读数，通过插值法计算由于蒸发导致的背景读数随时间的漂移，然后从每个时间点的读数中减去相应的插值背景值。

完成检测并校正蒸发效应后，粘弹性数据图被反转。瞬时力和松弛力的幅值在每一步逐渐增加，直至约 1,000 秒，随后随着悬韧带纤维开始断裂而下降，到 1,500 秒时间点时所有纤维均断裂。在本演示中，还比较了野生型小鼠与MAGP-1缺陷型小鼠的粘弹性反应。

在初始时间0至600秒内，两条曲线形态相似，表明悬韧带纤维的黏弹性性质未发生显著改变。然而，在MAGP-1基因敲除小鼠中，纤维会过早断裂。通过拉伸法测定了MAGP-1基因敲除小鼠与野生型小鼠在一个月龄和一岁龄阶段的悬韧带纤维断裂力。

结果表明，野生型小鼠的纤维强度随年龄增长而增加。在这些步骤中，任何对培养皿的意外接触都可能导致眼壁相对于晶状体发生移位，从而可能损伤悬韧带纤维。该拉伸实验有助于鉴定参与微原纤维抗张强度的蛋白质。

我们将利用这些信息构建更接近真实的悬韧带纤维内部结构模型。