分离、测序与分析人源间充质干细胞的细胞外微小RNA

这是首篇针对从细胞外囊泡来源的小RNA测序技术问题的研究论文。NGS样本需要严格的制备和质量控制。由于EVs的特性，EV样本的质量控制流程与常规方法有所不同。

本方案的优势在于为初次使用者设置了质量控制步骤。示范该操作的是我实验室的研究助理 Junyi Su。首先，在五个 T175 培养瓶中，用新鲜的 MSC 培养基以每平方厘米 2,000 个细胞的密度接种人源间充质干细胞。

然后在37摄氏度、5%二氧化碳环境中培养细胞，每两到三天更换一次培养基，直至获得五个达到90%汇合度的细胞培养瓶。接着，每瓶用20毫升PBS洗涤细胞三次。每瓶中加入20毫升细胞外囊泡收集培养基。

在37摄氏度、5%二氧化碳环境中孵育48小时。收集培养基，于300 ×g、4摄氏度条件下离心10分钟。然后收集上清液，并将培养基于2,000 ×g、4摄氏度条件下离心20分钟。

再次收集上清液，并将培养基在4°C条件下以15,500 ×g离心30分钟。最后一次收集上清液。接着，将培养基转移至超速离心管中。

此处使用 60Ti 固定角转子，沉淀物将附着在离心管的侧壁。在瓶盖上标记沉淀物预期所在的一侧，并在离心管侧壁画一个圆圈标示沉淀物预期位置。在 100,000 g 和 4 °C 条件下离心 90 分钟，使外泌体 RNA 沉淀。

最后一次离心后，弃去上清液。用小块吸水纸吸干管内壁，注意不要触碰到管底。然后将离心管倒置于吸水纸上。

为重悬沉淀，向每根离心管中加入 200 µL PBS，涡旋振荡 30 秒。上下吹打 20 次。随后采用纳米颗粒追踪分析法检测细胞外囊泡及其他生物分子。

将沉淀物保存在零下80摄氏度，直至进行后续实验。样品解冻后，使用RNA提取试剂盒，按照生产商的说明书提取RNA。用100微升无RNA酶的水从RNA提取试剂盒提供的柱子中洗脱RNA。

为了通过乙醇沉淀浓缩RNA，向100微升纯化的RNA中加入1微升糖原、10微升2摩尔pH 5.5的醋酸钠以及250微升预冷的99%乙醇。然后将样品在-20摄氏度孵育过夜，以沉淀RNA。为收集RNA沉淀，于4摄氏度下以16,000 g离心20分钟。

接下来，去除上清液，并用一毫升75%乙醇洗涤RNA沉淀。在16,000 g及4°C条件下再次离心五分钟，以沉淀RNA。去除乙醇后，将RNA管的管盖打开，静置五至十分钟，使RNA沉淀自然风干。

将RNA沉淀重悬于7 µL无RNA酶的水中，并使用基于芯片的毛细管电泳仪检测RNA的质量和浓度。开始文库构建时，用移液器将5 µL RNA加入预冷的0.2 mL PCR管中。接着，用无RNA酶的水按1:10的体积比稀释3'接头。

向RNA管中加入0.5 µL稀释后的接头，并用移液器轻轻吹打混合8次。短暂离心，使管壁所有液体聚集于管底。将RNA与接头的混合物置于预热的PCR仪中，在70 °C孵育2分钟。

然后将样品放回预冷的金属块上。接着，向RNA接头混合物中加入1微升连接缓冲液、0.5微升RNase抑制剂和0.5微升T4 RNA连接酶。轻轻吹打混匀8次，短暂离心。

然后将离心管置于预热的PCR仪中，在28摄氏度下孵育1小时。接着，向样本管中加入0.5微升终止液，期间保持离心管位于PCR仪内。上下吹打8次，并继续在28摄氏度下孵育15分钟。

将5'接头以1:10的体积比溶于无RNA酶的水中。取0.5微升稀释后的接头加入单独的0.2毫升PCR管中。将5'接头在70摄氏度加热2分钟。

然后将样品置于预冷的金属块上。向5'接头管中加入0.5 µL的10 nmol ATP和0.5 µL的T4 RNA连接酶。用移液器轻轻吹打混匀8次。

短暂离心以使所有液体聚集于管底。随后，向RNA样品中加入1.5 µL的5'接头混合物。轻轻吹打8次，于28 °C孵育1小时。

为了获得 cDNA，将反转录引物用无 RNA 酶的水按 1:10 的体积比稀释。取 0.5 微升稀释后的引物加入 RNA 样品中，轻轻吹打混匀 8 次，短暂离心。然后将 RNA 与引物混合物置于预热的 PCR 仪中，在 70 摄氏度孵育 2 分钟。

然后将样品置于预冷的冰块上。接着，向样品管中加入1微升5X第一链缓冲液、0.5微升12.5毫摩尔/升的dNTP混合物、0.5微升100毫摩尔/升的DTT、0.5微升RNA酶抑制剂以及0.5微升逆转录酶。轻轻吹打混匀8次。

短暂离心。将样品置于预热的PCR仪中，在50摄氏度孵育1小时。随后，向cDNA样品中加入4.25 µL超纯水、12.5 µL PCR混合液、1 µL索引引物和1 µL通用引物。

上下吹打8次，短暂离心。最后将样品放入PCR仪中，根据文稿设置PCR仪程序。为纯化RNA文库，使用自动化DNA片段分选仪回收140至160个碱基对之间的条带。

使用基于层析柱的PCR纯化试剂盒对提取的文库进行纯化，并用10微升无RNA酶的水洗脱文库。为检测文库片段大小，取1微升纯化后的文库上样至DNA芯片，并按照制造商的操作说明进行检测。为定量文库浓度，首先将1微升纯化文库以1:1,000的体积比稀释于含0.05%吐温20的10毫摩尔、pH 8.0的Tris-HCl缓冲液中。

然后使用商用文库定量试剂盒中的DNA标准品进行qPCR。最后，根据测序仪的要求等量混合文库，并在高通量测序系统上进行测序。细胞外RNA的电泳图谱包含多种大小的RNA。

相比之下，细胞RNA显示出非常明显的峰，对应于5S tRNA、5.8S rRNA、18S rRNA和28S rRNA。两个文库的最终质量均较高且具有可比性。两个文库的长度分布均在22个核苷酸处呈现单一峰，与microRNA相对应。

相比之下，细胞外RNA的文库更具异质性，包含两个额外的峰，分别对应于tRNA、tRNA的半分子和片段，或piRNA。细胞RNA中65%的读段比对到人类microRNA，而其他各类小RNA仅占比对读段的一小部分。相反，仅有8%的细胞外RNA与人类microRNA匹配。

测序读段比对到的最丰富的sRNA是tRNA，而未匹配上的读段后续比对到了细菌序列。与牛基因组的比对结果表明，FBS并非污染来源。因此，细胞外RNA表现出与正常细胞内RNA不同的异常谱型。

文库构建是本实验方案的关键步骤。混合操作必须非常轻柔，以避免产生气泡。该方法也可用于研究其他类型细胞中外泌RNA（exRNA）的谱型，有助于探索外泌RNA的功能。