小鼠脉络丛的显微解剖与整体封片扫描电镜可视化

为了更深入地了解脉络丛的组成和结构，首先至关重要的一步是建立一种高效的方法，从脑室中分离出脉络丛。利用这种显微解剖技术，可以在不破坏脉络丛功能、活性和结构，且避免周围组织污染的前提下，将其从脑室中完整解剖出来。脉络丛分离过程中的一个主要难点在于识别该结构，因为它仍漂浮于脑室内。

用溴酚蓝染色脉络丛有助于分离。演示该操作的将是我们的实验室主管Elien Van Wonterghem。首先准备终末麻醉剂、经心脏灌注溶液、扫描电子显微镜（SEM）所需的溶液以及其他文本中提到的溶液。

为分离小鼠脑组织，将深度麻醉的动物置于仰卧位，并用大头针将小鼠四肢固定于操作板上。使用碳钢手术刀片在膈肌下方约四厘米处做切口前，先用70%乙醇喷洒胸部进行消毒。用手术剪刀切开皮肤并暴露胸腔。

完全切开膈肌并分离胸腔，以暴露肺脏和跳动的心脏。使用灌注泵以每分钟4.5毫升的速度经心脏灌注10毫升灌注液。将26号针头插入左心室，将溶液泵入体循环系统。

使用手术剪剪开右心房，使血液流出循环系统。小鼠断头后，从两耳之间开始向眼睛上方做切口，切开头皮。将皮肤向两侧拉开，暴露颅骨。

然后沿着鳞状缝向鼻部方向剪开颅骨。操作完成后，将脑组织置于冰冷的培养皿中，并向脑组织加入一毫升冰冷的磷酸盐缓冲液（PBS）。为了分离漂浮在第四脑室中的脉络丛，需使用解剖刀小心地将小脑与大脑分离。

从小脑上移除残留的脑干组织部分。旋转脑组织，使切面朝上，确保第四脑室腔位于切片中央，脉络丛位于背侧。如有必要，可用尖头镊子牵拉结缔组织以打开脑室。

使用精细的尖头镊子轻轻地将脉络丛从脑室壁上撕下。为了从侧脑室中分离脉络丛，使用精细的尖头镊子将脑沿矢状面切成两个半球。旋转其中一个脑半球，使切面朝上。

轻轻将皮层从丘脑处分离，以暴露侧脑室。将海马向正中矢状切线方向牵开。此时侧脑室已可见，脉络丛位于脑室底部。

如有必要，可用尖头镊子轻轻拉开结缔组织，稍微打开脑室。使用微小的尖头镊子轻柔地将脉络丛从脑室壁上撕下。为进行扫描电镜样品制备，将 freshly 分离的脉络丛转移至 freshly 配制的固定液中，并在 4°C 下孵育过夜。

完成后，使用3至5毫升的0.1摩尔卡考基late钠缓冲液，每次5分钟，清洗样品三次。将样品在3至5毫升含2%四氧化锇的0.1摩尔卡考基late钠缓冲液中后固定30分钟。然后使用3至5毫升超纯水，每次5分钟，清洗样品三次。

接下来，使用浓度递增的冰冻乙醇溶液对样品进行脱水处理，每种乙醇溶液处理15分钟。使用临界点干燥仪对样品进行彻底干燥。将样品小心地用碳导电胶固定在样品台上，并利用扫描电镜（SEM）观察脉络丛样品。

本方案可高效分离小鼠脑侧脑室和第四脑室的脉络丛。使用溴酚蓝灌注可实现脉络丛的可视化。若后续处理步骤中不允许使用溴酚蓝，则采用PBS-肝素灌注或不进行灌注处理。

脉络丛上皮细胞（CPE细胞）表面的扫描电镜形态学分析清晰地显示出第四脑室的双臂结构，以及从侧脑室分离出的侧脑脉络丛典型的C形结构。更高倍数的扫描电镜放大图像揭示了CPE细胞顶侧存在囊泡样结构及微绒毛，表明可利用扫描电镜研究疾病状态下CPE细胞的形态学改变。操作过程中仅应接触并取出脉络丛组织，以避免周围组织对样本造成污染。

操作时需格外小心以保持脉络丛的结构完整。对分离出的脉络丛可应用多种后续技术，用于研究其结构与功能，包括显微镜分析、转录组分析以及流式细胞术等。通过显微解剖将脉络丛从脑组织中分离，有助于我们更深入地了解这一微小脑组织的结构与功能。

这一知识对于更深入地理解其在神经系统疾病中的作用至关重要。