利用电泳迁移率变动分析（EMSA）和DNA亲和沉淀分析（DAPA）筛选功能性非编码遗传变异

本实验策略的总体目标是研究与疾病相关的非编码变异体的功能。该方法有助于回答基因组学中的关键问题，例如，不改变氨基酸序列的遗传变异如何仍然导致疾病表型。该技术的主要优势在于，它为评估遗传变异的功能活性提供了简化的流程，并有助于揭示受影响的调控蛋白及相关通路。

该技术可促进对任何具有候选致病变异的疾病的研究。由于分析这些变异的流程具有普适性，不受所研究表型的影响。尽管该方法可为人类疾病提供见解，但也适用于任何生物体中的突变研究。

本实验将从B淋巴母细胞样细胞中制备核裂解物，但该方法可适用于大多数细胞系。使用血细胞计数板计数细胞后，离心收集所需数量的细胞用于裂解。吸除培养基，加入10毫升预冷的磷酸盐缓冲液（PBS），再次离心收集细胞。

用 PBS 再次洗涤细胞，离心后弃去 PBS。每 10 的 7 次方个细胞使用 1 毫升冰上预冷的 PBS 重悬细胞沉淀。将 1 毫升细胞悬液分装至 1.5 毫升微量离心管中，使每管含有 10 的 7 次方个细胞悬浮于 PBS 中。

离心两分钟，吸除PBS。加入含有1毫摩尔二硫苏糖醇（DTT）、1倍磷酸酶抑制剂和0.5毫摩尔苯甲基磺酰氟（PMSF）的工作浓度CE缓冲液。每份细胞沉淀用400微升该缓冲液重悬，并在冰上孵育15分钟。

向每支微量离心管中加入 25 µL 10% Nonidet P-40，用移液器吹打混匀。在 4 °C 条件下以最大速度离心 3 分钟。倾去并弃除上清液。

接下来，向NE缓冲液工作液中加入1 mM DTT、1×磷酸酶抑制剂和1 mM PMSF。用30 µL该缓冲液重悬每份细胞沉淀，并通过涡旋混合。在4 °C条件下，于旋转摇床上孵育10分钟。

离心两分钟。收集上清液，即为核裂解物。在储存于-80摄氏度之前，将核裂解物分装，以避免多次冻融循环导致蛋白质降解。

按照方案文本所述，首先配制50纳摩尔的寡核苷酸工作液。将寡核苷酸置于90摄氏度的加热块中孵育5分钟。5分钟后，关闭加热块，使寡核苷酸缓慢冷却至室温，冷却时间至少为1小时，之后方可使用。

接下来准备电泳迁移率变动分析（EMSA）凝胶。从预制的6%三羟甲基氨基甲烷-硼酸-EDTA（TBE）凝胶上取下胶板，用去离子水冲洗数次，以清除加样孔中的任何缓冲液。组装好凝胶电泳装置后，向内槽加入0.5×TBE缓冲液以检查是否漏液。

如果无缓冲液渗入外层室，则将外层室填充至约三分之二处。以100伏电压预电泳60分钟。预电泳完成后，用200微升0.5X TBE缓冲液冲洗每个加样孔。

配制结合缓冲液主混合液。在微量离心管中，混合以下所有反应共用的试剂：10× 结合缓冲液、DTT 吐温、Poly(dI-dC) 和鲑鱼精子 DNA。

为建立EMSA反应，向每根微量离心管中加入无核酸酶的水，使在加入所有试剂后最终体积为20 µL。向每根微量离心管中加入适量的预混液。向相应的微量离心管中加入8 µg的核裂解物。

设置不含核提取物但含有寡核苷酸的试管作为阴性对照。向相应的微量离心管中加入 50 飞摩尔（femtomoles）的寡核苷酸，并轻轻弹动混匀。短暂离心，使管内液体沉降至管底。

将所有离心管在室温下孵育20分钟。随后，向每个微量离心管中加入2 µL的10×橙色上样染料。用移液器吹打数次以混匀。

使用移液器反复吹打混匀样品，然后将每个样品分别加入预制的6% TBE凝胶的不同加样孔中。以80伏电压电泳约60至75分钟，直至橙色染料迁移至凝胶长度的三分之二至四分之三处。电泳完成后，使用凝胶撬刀撬开塑料胶盒。

将凝胶从夹心中取出，放入含有0.5% TBE缓冲液的容器中，以防止其干燥。将凝胶置于红外和化学发光成像系统的表面。去除可能干扰成像的气泡或污染物。

按照方案文本所述，使用扫描系统软件扫描凝胶。开始此操作前，按照方案文本所述配制5 µM的寡核苷酸工作液。将寡核苷酸置于95 °C的加热块中孵育5分钟。

五分钟后，关闭加热模块，使引物在使用前缓慢冷却至室温。将以下缓冲液升温至室温：结合缓冲液、低严谨性洗涤缓冲液、高严谨性洗涤缓冲液和洗脱缓冲液。为每种变异体制备结合混合液。

将一体积的核裂解液与两体积的结合缓冲液混合。加入1倍量的磷酸酶抑制剂、0.5毫摩尔的PMSF和1倍量的结合增强剂。向每份结合混合物中加入10微升浓度为5微摩尔的生物素标记捕获DNA。

通过轻轻弹击管壁数次进行混匀。将结合混合物在室温下孵育20分钟。接着，向每份结合混合物中加入100 µL链霉亲和素MicroBeads。

室温孵育10分钟。针对每个待检测的寡核苷酸探针，将结合柱置于磁力分离器中。确保结合柱上标注了结合反应混合物中所使用的寡核苷酸变异体。

将微量离心管直接置于每个结合柱下方，并加入100 µL结合缓冲液冲洗柱子。用移液器将每种结合混合物分别加入不同的柱子中。让液体完全流过柱子进入微量离心管中。

向柱中加入100微升低严谨性洗涤缓冲液，等待柱储液室排空。再次向柱中加入100微升低严谨性洗涤缓冲液。向柱中加入100微升高严谨性洗涤缓冲液，等待柱储液室排空。

再次向柱中加入100微升高严谨性洗涤缓冲液。向柱中加入30微升天然洗脱缓冲液，静置5分钟。最后再加入50微升天然洗脱缓冲液，以洗脱结合的转录因子。

为了探究电泳迁移率变动分析（EMSA）结果的可重复性以及冻融循环的影响，使用含有遗传变异参考等位基因或非参考等位基因的寡核苷酸探针，在多次冻融循环后检测同一份B淋巴细胞核提取物。蓝色箭头指示游离探针。转录因子与寡核苷酸结合后在凝胶上半部分形成条带，由红色箭头标示。

这些结果表明，对此特定核提取物进行多达五次的冻融，似乎对蛋白质的完整性没有影响。此外，优化 EMSA 的信噪比也非常重要。实验中使用了不同浓度的寡核苷酸来检测同一批制备的核裂解液。

随着寡核苷酸量增加至100飞摩尔，条带强度也随之增强。此处展示了一项关于系统性红斑狼疮相关风险等位基因研究的代表性结果。转录因子STAT 1首先通过DAPA方法被鉴定，随后进行蛋白质组学分析。

随后通过DAPA蛋白印迹实验确认了STAT1的身份，并证实磷酸化形式的STAT1与狼疮风险寡核苷酸具有更高的结合能力。在完成该步骤后，可进一步采用其他技术，如质谱分析和蛋白印迹实验，以帮助我们鉴定出具有等位基因依赖性结合特性的调控蛋白。

诸如荧光素酶报告基因检测等方法也可用于研究基因表达随等位基因变化的情况。