使用红外荧光染料标记寡核苷酸的电泳迁移率 shift 实验优化方案

本实验的总体目标是利用非放射性探针检测蛋白质-DNA 相互作用。该方法有助于解答分子生物学和生物化学领域中的关键问题，例如确定蛋白质的 DNA 靶序列。该技术的主要优势在于，它是一种简便、安全且节省时间的放射性探针替代方法。

开始此实验步骤时，使用微型蛋白凝胶系统制备含有0.5×三羟甲基氨基甲烷硼酸盐EDTA（TBE）和2.5%甘油的5%天然聚丙烯酰胺凝胶。为制备用于四块凝胶的30毫升凝胶溶液，混合蒸馏水、TBE、过硫酸铵、TEMED、丙烯酰胺双丙烯酰胺（acrylamide bis）和甘油。立即灌注凝胶溶液。

聚合完成后，用预先用0.5x TBE润湿的透明塑料膜包裹凝胶，并在4摄氏度下保存。接下来，设计一条长约51个核苷酸的长链寡核苷酸。设计约14个核苷酸的互补短链寡核苷酸，并在其5'末端进行红外荧光染料修饰。

寡核苷酸制备完成后，将其重悬于1× Tris-EDTA缓冲液中，终浓度为100微摩尔。退火时，在1.5毫升离心管中加入0.6微升5'端标记荧光基团的短寡核苷酸、1.2微升长寡核苷酸以及28.2微升氯化钠-Tris-EDTA缓冲液，混匀。将离心管置于沸水中5分钟，随后关闭热源，使含退火后寡核苷酸的溶液在避光条件下过夜自然冷却。

制备双链DNA探针时，将30微升退火后的寡核苷酸与dNTPs、Klenow缓冲液、Klenow 5'染料标记物及重蒸水混合于0.2毫升PCR管中。在PCR仪中37摄氏度孵育60分钟。随后加入3.4微升0.5摩尔EDTA以终止反应，并在PCR仪中75摄氏度加热失活20分钟。

随后，用氯化钠-TE缓冲液将填满的探针稀释至终浓度为0.1微摩尔。将寡核苷酸在避光条件下于-20摄氏度保存，直至使用。制备未标记探针时，取20微升长链寡核苷酸、20微升Long R寡核苷酸以及60微升氯化钠-TE缓冲液，加入1.5毫升离心管中混合均匀。

将试管放入沸水中加热五分钟，然后关闭热源，使含有退火寡核苷酸的水过夜自然冷却。通过混合 Tris HCl、Sodium Chloride、Potassium Chloride、Magnesium Chloride、EDTA、DTT、BSA 和双蒸水，制备一毫升 5x 结合缓冲液。在进行结合反应前，先用 0.5x TBE 和 2.5% 甘油预电泳 5% 天然聚丙烯酰胺凝胶，在 80 伏电压下电泳 30 分钟至一小时，或直至电流不再随时间变化，以彻底去除过硫酸铵残留。

接下来，将4微升5x结合缓冲液、80至200纳克纯化的蛋白A、1微升0.1微摩尔浓度的染料标记探针以及双蒸水混合。在室温避光条件下孵育15分钟。孵育结束后，将全部结合反应产物上样至凝胶，并以每厘米10伏的电压电泳至目标距离。

用铝箔覆盖凝胶装置，尽可能使凝胶保持在黑暗环境中。使用蒸馏水清洁红外成像系统的扫描仪玻璃板。将含有凝胶的玻璃板擦干，并放置在扫描仪玻璃板上。

打开红外成像软件，点击“采集”选项卡。对于较厚的板，使用以下设置：通道为700，强度为自动，分辨率为84微米，质量为中等，焦距偏移为3.5毫米。在扫描仪上选择凝胶所占据的区域。

最后，单击“开始”以启动扫描。电泳进程可通过橙G加样染料进行观察，而溴酚蓝在扫描过程中会被检测到，因而会干扰图像分析。在结合反应中加入dI-dC可消除纯化的6xHis-SOX-2与5'端标记染料DNA探针的结合。

LIM-4突变体以及在LIM-4结合位点发生突变的SOX-2冷探针，在与红外荧光染料标记的探针竞争结合6xHis-SOX-2时，其竞争效率与野生型冷探针相当。然而，在SOX-2结合位点发生突变的LIM-4和SOX-2双突变冷探针，其与6xHis-SOX-2结合的竞争效率显著低于野生型冷探针。利用6xHis和flag表位对SOX-2 DNA复合物进行超迁移实验，结果观察到SOX-2 DNA条带发生超迁移。

一旦掌握，该技术若操作得当，可在两到四小时内完成。在进行此操作时，重要的是要记住将红外探针保持在避光环境中。在此步骤完成后，还可采用其他方法（如 CRISPR cas9 基因组编辑）来回答更多问题，例如特定 DNA 结合序列的重要性。

该技术问世后，为生物化学领域的研究人员探索多种模式生物中的蛋白质-DNA相互作用铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用非放射性DNA标记来检测蛋白质-DNA相互作用。请注意，丙烯酰胺具有极高的危险性，在操作该实验步骤时，必须始终采取适当防护措施，例如佩戴个人防护装备。