小鼠小肠淋巴细胞的分离与流式细胞术表征

本实验的总体目标是从不同小肠区室中分离出单细胞群体，随后可用于流式细胞术分析或其他表征手段。该方法有助于回答黏膜免疫学中的关键问题，例如微生物群如何影响肠道免疫系统的发育。该技术的主要优势在于操作快速、可重复性强，且无需繁琐的Percoll梯度离心步骤。

开始此操作时，将小鼠背侧朝下放置，并用70%乙醇喷洒腹部，沿腹侧中线从耻骨联合至剑突依次切开皮肤和腹膜筋膜，进行剖腹手术，从而暴露腹腔。接下来，横断幽门括约肌，将小肠与胃分离。轻柔地将小肠从腹膜中取出，并剥离肠系膜脂肪。

为完全切除小肠，需在回盲交界处进行第二次切割。将分离的小肠置于含有10%胎牛血清（FBS）的4°C RPMI培养基中，以最大程度维持细胞活性。使用弯头镊子轻轻去除大块脂肪组织，并在操作过程中注意避免撕裂肠组织本身。

为清除肠内容物，使用连接注射器的18号喂养针插入小肠近端，用15至20毫升冷PBS轻轻冲洗肠道。用剪刀切除位于小肠对系膜侧、呈多叶状白色团块的派伊尔结。随后将其置于含有5% FBS的冷RPMI培养基中。

接下来，将小肠切成3至4英寸长的片段，用浸有RPMI的纸巾滚动每个小肠片段以去除残留脂肪，并使用钝性解剖刀将脂肪从组织上轻轻剥离。必须严格注意彻底清除肠系膜脂肪，因为即使微量脂肪也可能导致淋巴细胞死亡，从而影响细胞活力。随后，用弯头镊子插入肠段并夹住组织远端，将组织翻转至内侧朝外；再用一对直头镊子从近端轻轻将组织片段取下，从而使组织完全翻转。

将组织片段放入含有30毫升提取液和一个搅拌子的杯子中。盖紧杯盖，在37摄氏度下搅拌15分钟。搅拌应充分剧烈，但不得产生湍流。

15分钟后，使用钢制滤网将组织块与含有上清液的上层液体分离，上清液应呈浑浊状。用手在RPMI培养基中轻轻搅动组织块，以洗去残留的提取液。然后将组织置于干燥的纸巾上，并反复翻转数次，以促进去除未被提取液释放的残余黏液。

随后，将组织碎片放入含有 600 微升消化液的 1.5 毫升离心管中。剪切组织直至碎片不再粘附于剪刀，且溶液呈现均匀状态。此步骤至关重要，以确保组织得到完全的酶消化。

将组织剪碎至组织碎片不再粘附剪刀且溶液呈现均一状态，对于确保细胞得率以及实验结果的可重复性至关重要。将剪碎的小肠组织加入含有25毫升消化液的容器中，在37摄氏度下搅拌消化30分钟。消化进行至一半时，使用血清移液管反复吹打溶液，以帮助分解可能存在的较大组织块。

接下来，将消化后的组织通过100微米细胞滤筛过滤至一个15毫升离心管中。用20毫升含10%胎牛血清（FBS）的RPMI培养基冲洗滤筛。随后，将过滤后的溶液在4°C下离心10分钟。

小心倒出上清液，并将沉淀物重悬于1毫升含10% FBS的RPMI培养基中。将重悬的细胞通过40 µm细胞滤网过滤至15毫升离心管中。用20毫升含10% FBS的RPMI培养基冲洗滤网。

随后，将过滤后的溶液在4°C下离心10分钟。小心倾去上清液，并将沉淀物重悬于1 mL含2% FBS的RPMI培养基中。在此步骤中，将切除的派伊尔结转移至含有25 mL消化液和一个搅拌子的杯中。

盖紧盖子，在37摄氏度下离心10分钟。随后，将消化后的派伊尔结通过40微米细胞滤网过滤至15毫升离心管中。若仍有团块残留，使用1毫升注射器推杆的平头端将团块压过滤网。

然后，用 10 毫升含 10% FBS 的 RPMI 培养基冲洗滤网。将过滤后的溶液在 4°C 下离心 10 分钟。随后，小心弃去上清液，并将沉淀物重悬于 1 毫升含 2% FBS 的 RPMI 培养基中。

对小肠淋巴细胞单细胞悬液进行流式细胞术分析时，应获得一群具有与脾细胞相似的前向散射和侧向散射特征的明确细胞群体。在分离初期，如果组织未保持在4°C条件下，淋巴细胞可能开始死亡，导致淋巴细胞群体的前向散射信号降低，且更难以与其他上皮细胞和死细胞分离。此外，若未将小肠组织中的肠系膜脂肪完全去除，则几乎会导致淋巴细胞的完全丢失。

通常，小肠固有层淋巴细胞的存活率可达80%。熟练掌握后，可在不到四小时内处理四只小鼠，并制备好用于染色的单细胞悬液。在该操作过程中，彻底去除所有肠系膜脂肪并充分剪碎组织以确保完全消化至关重要。

通过该方法制备的单细胞悬液可用于流式细胞术以外的其他用途，例如体外实验、基因表达分析或过继性转移，以进一步表征这些细胞的功能。该技术建立后，为黏膜免疫学领域的研究人员探索小鼠肠道免疫系统的发生发育及其功能意义奠定了基础。观看本视频后，您应能够充分掌握如何从小鼠小肠不同区室中分离单细胞悬液，具体步骤包括清除肠系膜脂肪、分离上皮层以及使用胶原酶消化组织。