通过光谱流式细胞术分析从实体组织中分离的细胞悬液

该光谱流式细胞术的总体目标是利用不同荧光染料的完整发射光谱来区分它们。此外，本方案能够将自发荧光作为一个独立参数加以利用，从而实现对从实体器官中分离的细胞进行准确分析。该方法有助于回答免疫学和干细胞生物学发育领域中的关键科学问题，例如如何鉴定稀有细胞群体。

该技术的主要优势在于其能够同时分析大量参数，并有效处理固体组织的自发荧光。尽管该方法常用于制备源自小鼠肠道和心脏的单细胞悬液，但也可应用于其他器官，如肺、骨骼肌、肝脏、脂肪和肾脏。首先，从小鼠体内分离出成年小鼠的小肠并进行洗涤。

然后，将组织置于一张纸巾上，使用锋利的剪刀小心地去除派伊尔结。沿肠管纵向剪开，并将其切成1厘米长的小段。接着，将组织转移至含有30毫升HBSS（添加10% FCS）的烧杯中，在37°C条件下持续搅拌孵育30分钟。

孵育完成后，将细胞悬液转移至15毫升塑料管中，剧烈涡旋振荡5分钟。然后将悬液置于冰上孵育10分钟，使较大的未解离组织碎片沉降。随后，将上清液转移至新管中，在120 × g 条件下离心7分钟以收集细胞。

离心成团后，将细胞重悬于10毫升含1% FCS的HBSS中，并使用血细胞计数板进行计数。在细胞染色前，取1×10⁶个肠细胞转移至一支5毫升离心管中，用于制备阴性对照。制备待测样品时，向一支新的5毫升离心管中加入1×10⁶个肠细胞，随后加入2毫升含1% FCS的HBSS，混匀后于4°C、120 × g离心5分钟。

弃去上清液后，将细胞重悬于50微升抗体溶液中。用铝箔包裹试管，在4摄氏度下孵育20分钟。孵育结束后，向样品中加入2毫升含1% FCS的HBSS溶液，在4摄氏度下以120 × g离心5分钟。

弃去上清液，将沉淀重悬于200微升含0.5微克/毫升碘化丙啶的溶液中。将小鼠胚胎断头后，将其躯体置于盛有50毫升含1%胎牛血清的HBSS溶液的培养皿中，培养皿底部垫有预先润湿的滤纸。在体视显微镜下，于胚胎胸部右侧做一切口，小心打开胸腔，注意避免损伤心脏。

抓住大血管，取出与肺和胸腺相连的心脏。将器官转移至一个含有2毫升含1% FCS的HBSS的35毫米培养皿中。然后，从周围器官和结缔组织中分离出心脏。

清洗心脏后，将其浸入1毫升预热的酶溶液中，使用精细镊子和手术刀在体视显微镜下将器官切成1立方毫米大小的组织块。加入额外的1毫升预热酶溶液，将组织碎片转移至一个带盖的5毫升离心管中。将样品于37摄氏度下水平孵育15分钟。

孵育完成后，使用 P1000 移液器反复吹打悬浮液，使组织充分匀浆。然后将样品垂直静置，直至未消化的组织碎片沉降。将上清液转移至 50 毫升离心管中。

加入2毫升含10% FCS的HBSS，并将分离的细胞置于冰上。接着，向含有未消化组织沉淀的5毫升离心管中加入2毫升预热的酶溶液，并继续消化组织，直至观察不到残留组织，如前所述。将获得的细胞悬液在120 × g下离心10分钟。

然后，弃去上清液，并将细胞重悬于1毫升含1% FCS的HBSS中，HBSS中不含钙和镁阳离子。为染色心肌细胞，将200微升细胞悬液转移至圆底96孔板的孔中。以480 × g离心1分钟，然后弃去上清液。

接下来，将心肌细胞重悬于100微升抗体溶液中。用铝箔纸包裹培养板，在4摄氏度条件下孵育20分钟。孵育完成后，使用200微升含1% FCS的无钙、无镁HBSS缓冲液洗涤心肌细胞，并在480 × g条件下离心1分钟。

然后，将细胞重悬于200微升含1%胎牛血清（FCS）的无钙、无镁HBSS缓冲液中，并将该悬液转移至预先加入200微升含1% FCS的无钙、无镁HBSS缓冲液的5毫升离心管中。最后，加入400微升含1% FCS、0.5微克/毫升碘化丙啶的无钙、无镁HBSS缓冲液，并通过70微米尼龙滤网过滤细胞悬液。为观察细胞，将染色后的样本上机进行流式细胞术检测，点击预览，随后通过点击采集记录样本中最多2×10⁶个事件。

在分析选项卡中，打开颜色面板窗口，并通过添加荧光染料及其对应的标记物来登记所有研究参数。务必包含自发荧光和细胞活性参数。在控制窗口的试管列表中，分析第一个含有补偿微珠的单染样本。

然后，在工作表中点击多边形设计工具，在FSC-SSC图中圈选微球群体。双击该门控以创建已圈选微球的子代图。接着分别圈选阳性与阴性微球。

通过连续设门并逐个剔除每个阳性与阴性组分中的异常值，验证所选的子代细胞群体。然后，在解混窗口中上传阴性和阳性设门。接着，在样本管列表中选择未染色细胞样本，并分别为自发荧光细胞和非自发荧光细胞设计独立的设门。

在定义所有参数（包括自发荧光和细胞活力）的阴性门和阳性门后，单击“计算”。然后，对分析的样本应用解混。分析数据时，在SSC与FSC的散点图中圈选细胞，并排除经碘化丙啶染色的死细胞。

最后，确定所有目标细胞群的设门策略。此处展示的是从胎心分离的细胞经抗TER119、抗CD45和抗Sca-1抗体染色后，通过流式细胞术和光谱细胞术分析得到的结果。两个传统细胞仪检测到一群自发荧光细胞，而在光谱细胞术中，这些细胞未被识别为自发荧光细胞，而是被归入CD45 TER119阴性细胞群中。

通过传统流式细胞术鉴定为自发荧光但非 CD31 阳性的细胞，随后被分析其心肌细胞特异性转录本的表达情况。在自发荧光细胞群体中检测到高水平的心肌肌钙蛋白和类似心房肌细胞的转录本，证实了在传统流式细胞术中遗漏了大量心肌细胞亚群。一旦掌握该技术，若操作得当，可在约八小时内完成。

进行该实验操作时，重要的是要牢记所有步骤均需在冰上及时完成，以确保细胞保持活性。完成该操作后，可进一步开展细胞内蛋白检测以及额外表面标志物的分析，从而探究特定分子通路的相关问题。该技术为免疫学、发育生物学或干细胞生物学领域的研究人员探索并分离来自不同器官的稀有细胞群体奠定了基础。

观看本视频后，您应能够充分理解如何从细胞组织中分离并染色细胞，以及如何通过光谱流式细胞术分析表面标志物的表达，从而克服细胞自发荧光带来的局限性。请注意，使用碘化丙啶具有极高的危险性，在进行该操作时，必须采取适当的防护措施，例如穿戴个人防护装备（PPE）。