一种无缝克隆方法用于构建猪繁殖与呼吸综合征病毒表达载体

本方案展示了如何构建长片段且复杂的基因表达载体。当无法通过单次PCR从cDNA中获得全长片段，或无法通过体外多片段插入同源重组获得全长基因表达载体时，可采用本方法。目前，通过多片段连接克隆技术将全长DNA片段克隆至合适的载体中。

该方法可实现靶基因的删除或突变，并能高效地将大量DNA片段连接至表达载体。首先，打开软件，选择创建新的DNA文件选项。从NCBI获取PRRSV基因序列，然后点击“确定”以生成序列文件。

分析序列并标记片段连接处。在为片段设计特异性序列引物之前，先确定所有连接位点。然后，点击引物并选择添加引物。

粘贴特定序列，并将载体的重叠序列添加至引物的前五个 5' 端核苷酸。命名正向引物，然后单击“将引物添加至模板”，以将设计好的引物整合到模板中。随后，标记片段连接位点，并设计片段的反向特异性序列引物。

再次进入引物页面，选择“添加引物”。输入特定序列，并将限制性酶切位点添加至5′端前五个核苷酸处。

此外，在限制性酶切位点的5′端最前端添加20至40个碱基对的载体突出序列。命名反向引物，并选择“将引物添加至模板”。接下来，使用六个片段及设计好的引物对，建立六个独立的PCR反应。

按照此处所示的三步法进行PCR反应。PCR完成后，取1微升6x DNA上样缓冲液与5微升PCR产物混合，混匀后短暂离心。

使用1%琼脂糖凝胶电泳分析样品。为构建全长基因，通过六轮PCR反应扩增PRRSV的片段。通过琼脂糖凝胶电泳确认各片段的大小。

首先将载体线性化。在室温下配制含有特定限制性内切酶的反应混合物。使用凝胶回收试剂盒纯化线性化后的载体，然后在37摄氏度孵育60分钟。

然后，构建ExonArt无缝克隆与连接反应以亚克隆PRRSV基因。用灭菌去离子水将总体积调整至10 µL，充分混匀。

将混合物置于50摄氏度的PCR仪中孵育15至60分钟。随后将样品置于冰上保存。将载体转化至感受态细胞后，挑取8个菌落加入含卡那霉素的20 µL LB培养基中。

建立菌落PCR反应以分析转化子。通过将PRRSV片段1插入pVAX1载体中，获得全长PRRSV过表达载体pVAX1-F1。利用特异性限制性内切酶进行连续的重组反应，将片段2至片段5依次插入载体，通过质粒大小的增加可观察到重组结果。