基于显微镜的高通量筛选参与宿主因素的检测方法 布鲁氏菌 Hela细胞感染

本高通量显微镜检测方法的总体目标是鉴定参与布鲁氏菌感染 HeLa 细胞的宿主因子。该方法有助于解答宿主-病原体相互作用领域中的关键问题，例如鉴定促进或抑制胞内病原体布鲁氏菌定植的宿主蛋白。该技术的主要优势在于，从验证实验到图像分析的半自动化工作流程使得机器人能够高效地开展高通量实验。

因此，该方法可利用siRNA筛选来揭示布鲁氏菌与宿主之间的相互作用。大部分实验方案也可应用于其他筛选策略，例如siRNA文库。

按照文本方案培养HeLa细胞，并用siRNA制备筛选板后，通过在室温下以300 × g离心20分钟，使一块黑色384孔板解冻。使用不含FCS的室温DMEM制备转染培养基。将转染试剂按1:200稀释，并在使用前轻轻混匀。

使用试剂分配器向384孔板的每个孔中加入25微升转染培养基，并通过前后移动平板混合溶液。将平板在室温下孵育1小时，以使siRNA转染试剂复合物形成。在此期间，通过抽吸培养基并加入2.5毫升含0.05%胰蛋白酶EDTA的PBS，洗涤一个75平方厘米培养瓶中亚融合状态的HeLa细胞一次。

然后加入1.5毫升新鲜的胰蛋白酶，将培养瓶置于37摄氏度孵育2至3分钟，直至细胞变圆。使用10毫升预热的含60%FCS的DMEM培养基重悬细胞。接着，使用自动细胞计数仪对细胞进行计数，并在含16%FCS的DMEM培养基中制备每毫升10,000个细胞的细胞悬液。

向每孔转染试剂中加入 50 µL 细胞悬液，使每孔含有 500 个细胞。前后移动培养板以均匀分散细胞。

然后，将培养板置于室温下静置5至10分钟，使细胞沉降。用封口膜密封培养板，并将其置于加湿培养箱中，在预热的铝板上于37摄氏度、5% CO₂条件下孵育72小时。

操作三类病原体布鲁氏菌（B. abortus）具有危险性，必须遵守当地的生物安全法规，包括穿戴防护连体服、防护手套、口罩和护目镜。感染前一天，将先前确定数量的布鲁氏菌起始培养物接种于50毫升TSB KM培养基中，置于250毫升带螺旋盖的瓶内。

用封口膜密封瓶子，在摇床中于 37°C、100 RPM 条件下培养细菌过夜，使光密度达到 600 nm 处的 0.8 至 1.1。测定细菌培养物在 600 nm 处的光密度，并通过将细菌培养物用含 10% FCS 的 DMEM 培养基稀释，制备感染用培养基，以达到所需的感染复数。

或者，使用自动洗板机将转染培养基更换为50 µL感染培养基。在生物安全柜内将培养板转移至离心机转子中，于400 ×g、4 °C条件下对384孔板离心20分钟。

然后，用封口膜密封培养板，置于预热的铝板上，在37摄氏度、5% CO2条件下孵育4小时。孵育结束后，使用自动洗板机，以含10% FCS并添加100微克/毫升链霉素或GM的DMEM洗涤细胞，以灭活胞外细菌。随后，用封口膜重新密封培养板，放回孵育箱内预热的铝板上，继续孵育40小时，用于终点检测。

为了固定细胞，首先使用 PBS 清洗孔板。然后将 PBS 更换为 50 微升 3.7% PFA，pH 值为 7.4。

在室温下孵育细胞20分钟。孵育结束后，使用50 µL PBS更换固定液。使用自动化酶标洗板机对样品进行染色时，首先加入50 µL含1% Triton X-100的PBS溶液，作用10分钟，以通透细胞。

使用 PBS 洗涤细胞三次后，加入 50 µL 含 1 µg/mL DAPI 的 PBS，室温孵育 30 分钟。随后用 PBS 洗涤细胞三次，并避光保护。将培养板转移至自动显微镜下进行观察。

设置显微镜参数。选择10倍物镜，然后选择与384孔板相对应的板型格式。

每孔采集九个位点。选择启用基于激光的聚焦，并对焦于培养板和孔底。

然后，将首次获取的孔设为寻找样本的初始孔，并作为所有位点的自动对焦位置。接下来，针对DAPI通道手动调整Z轴偏移以实现对焦。随后，按下“寻找样本”按钮，以将焦点设定在孔底。

使用自动曝光（AutoExposure）功能获取曝光时间的良好估计值。手动调整DAPI通道的曝光时间，以确保具有较宽的动态范围且过曝程度较低。使用此曝光时间对整个孔板中的多个位点进行成像。

手动调整曝光时间，直到最亮像素在各个位点上的亮度达到最大亮度的约80%。针对所有其他通道，重复上述步骤以相应设置焦距和曝光时间。然后，开始全板的图像采集。

对于终点检测，使用 DAPI 和 GFP 通道对整块培养板进行成像。若需对终点检测中染色的细胞进行图像分析，在根据文本方案计算出明场校正模型后，于“查看输出设置”下选择包含图像的输入文件夹和存储结果的输出文件夹。随后，定义图像名称中共同包含的文本，并加载明场校正模型。

单击“开始测试模式”，并确保所有模块的暂停和显示设置均已禁用。仅启用第九模块 ImageMath 的暂停和显示设置。启用后，暂停符号将显示为黄色。

启用的显示功能将显示为睁开的眼睛。接下来，单击“运行”以运行至第九模块的分析。在第九模块中，调整参数“将第二张图像乘以”的数值，以抑制布鲁氏菌中的DAPI信号，同时不抑制细胞核信号。

要测试模块的数值，请点击“Step”。右键单击新打开的图像，并将图像对比度设置为对数归一化。然后反复返回至第九个模块。

调整参数以乘以第二幅图像，并再次逐步执行该模块，直至布鲁氏菌信号被完全抑制，同时尽量减少显示过度减除的黑色区域。为特定模块寻找合适的参数需要逐步优化参数。务必反复执行这些模块，尝试不同的参数值，并观察其对显示结果的影响。

启用模块10的暂停和显示功能。识别主要物体。设置阈值的参数下限，使其足够高，以实现细胞核的分割并忽略背景。

为了确定一个合适的阈值，可先在模块中逐步调整，然后右键单击输入图像并显示直方图，其中峰值通常代表背景。从背景强度开始，逐步增加参数，直至输出图像中实现良好的细胞核分割效果。图像分析流程的目标是识别出含有正在复制的细菌的细胞。

通过为病原体信号在细胞核、核周区域和Voronoi细胞体中设置不同的阈值来实现此操作。启用模块15的暂停和显示功能。如前所示，对对象进行过滤，然后点击运行。

将参数最小值设置得足够高，以确保仅保留细胞核内布鲁氏菌清晰可见的细胞，其余细胞均被过滤掉。为确定合适的数值，可逐步调整模块并显示输出图像，逐步提高该值，直至仅保留细胞核内布鲁氏菌清晰可见的细胞。

根据文本方案，筛选出第16和第17模块中细胞核周含有细菌且具有Voronoi细胞体的细胞后，退出测试模式，并取消勾选模块旁所有的眼睛符号，以确保在运行完整分析之前，没有任何模块显示其视图。最后，点击“Analyze Images”以开始分析。分析完成后，检查生成的PNG图像以及CSV表格文件，确认分析在整个孔板上均可靠地完成。

根据文本方案进行侵入实验和感染评分。该图展示了在终点实验中用于自动识别感染细胞的图像分析示例。使用DAPI染色的HeLa细胞细胞核已被识别。

计算出围绕细胞核、宽度为8像素的核周区域，以及通过将细胞核延伸25像素所获得的Voronoi细胞区域。若病原体信号在至少一个区室中超过相应阈值，则判定该细胞被感染。

布鲁氏菌需要通过肌动蛋白重排来成功侵入宿主细胞。因此，ARP2/3复合物的耗竭可作为siRNA筛选的合适阳性对照。在感染后两天，ARPC3的耗竭减少了含有增殖细菌的细胞数量。

与经乱序序列处理的对照细胞相比。通过自动图像分析可定量观察到，ARPC3 耗竭的 HeLa 细胞感染率较对照细胞降低，如本图所示。在入侵实验中，ARPC3 耗竭同样显示出布鲁氏菌感染率较对照细胞下降。

如黄色所示的细胞内布鲁氏菌数量减少。最后，通过自动图像分析对感染情况进行定量分析，结果证实，ARPC3 耗竭可降低感染细胞的数量以及感染细胞内细菌的数量。掌握本方案后，实验开始一个半月内即可获得图像分析结果。

在尝试此操作时，重要的是要仔细审阅图像分析结果，以确保所选参数在整个培养板上均能良好运行。完成此操作后，可进行其他方法，如活细胞成像，以回答更多科学问题，例如在布鲁氏菌感染过程中，特定宿主因子与布鲁氏菌发生相互作用的情况。

或者基因的耗竭如何影响细胞内感染的动态过程。该技术建立后，为感染生物学领域的研究人员探索布鲁氏菌在HeLa细胞感染中所需的宿主因子提供了途径。观看本视频后，您应能充分理解如何鉴定促进或抑制胞内病原体流产布鲁氏菌成功定植HeLa细胞的宿主因子。

请注意，操作布鲁氏菌（Brucella abortus）可能具有极高危险性，必须严格遵守当地的生物安全法规。