在球形乳液液滴中重建基础有丝分裂纺锤体

本实验的总体目标是在油包水乳液微滴的几何限域环境中重建有丝分裂纺锤体样结构。该方法有助于回答有丝分裂纺锤体组装领域中的关键问题，例如纺锤体是如何定位和组装的，以及各个组分在这些过程中所起的具体作用是什么？该技术的主要优势在于，我们采用自下而上的策略，在模拟有丝分裂细胞形态的几何限域条件下重建纺锤体样结构。

该方法也可用于研究其他依赖细胞限制性的过程。将10份PDMS预聚物与1份固化剂混合，总质量约为40克。然后将混合物置于真空腔室中约30分钟，以去除气泡。

同时，用铝箔包裹模具，制作一个深度为一厘米、直径为四英寸的杯状结构。准备就绪后，将约四分之三的PDMS混合物倒入模具中。然后，将PDMS再次放入真空腔室中抽真空30分钟。

脱气后，在 100 摄氏度下固化 PDMS 一小时。同时，用压缩空气吹去一些载玻片表面的灰尘，以备旋涂使用。然后，将剩余的 PDMS 混合物旋涂到载玻片上。

将这些载片在 100 摄氏度下固化一小时，以硬化 PDMS。接着，用剃刀片轻轻剥离 PDMS，并在 PDMS 片上打孔，制备所需的微流控芯片。然后，对微流控芯片和涂有 PDMS 的玻片进行几秒钟的电晕处理。

最后，将微流控芯片放置在每块载玻片上，芯片通道面朝下，并在100摄氏度下烘烤过夜。首先，使用经氯仿清洗过的玻璃器皿，配制约250微克溶于氯仿的脂质。用惰性气体小心地将脂质混合物吹干。

然后将其放入真空室中处理一小时。接着，将脂质溶解于矿物油和2.5%表面活性剂中，浓度为0.5毫克/毫升，体积约为500微升。为完全溶解脂质，将混合物在40千赫兹条件下超声处理30分钟。

接下来，将PDMS旋涂在盖玻片上，其厚度需与显微镜物镜相匹配。然后，将PDMS旋涂在载玻片上。随后，在100摄氏度下对涂有PDMS的盖玻片和载玻片进行固化，持续一小时。

然后，通过将实验室密封膜的薄片紧密地放置在涂有PDMS的玻璃载片上，制备流动池。将宽度约为三毫米的密封膜条以约两毫米的间距排列。接着，用涂有PDMS的盖玻片覆盖流动池，并在100摄氏度下加热约一分钟以熔化密封膜，从而密封整个装置。

加热后，轻轻将盖玻片压下，并用瓦拉普（Valap）密封。接着，准备用于长期成像的聚二甲基硅氧烷（PDMS）小杯。在一片厚度为三毫米的PDMS上打一个直径为四毫米的孔。

然后，对PDMS切片和涂有PDMS的盖玻片进行电晕处理。处理完成后，将两者叠放在一起，并在100摄氏度下烘烤过夜。在倒置明场显微镜下观察液滴的形成情况。

将脂质油相连接至压力控制器，并增加压力，直至油滴从尖端管路中流出。将尖端管路连接至微流控芯片的入口二，然后从入口二完全填充微流控芯片中的脂质油相。

接下来，从入口一引入基于MRB-80的水相。通过调节脂质油相和水相的压力来控制液滴大小，形成直径约为15微米的液滴。脂质油相压力约为800毫巴，水相压力约为200毫巴，可作为合适的起始条件。

在获得所需液滴尺寸后，用液滴完全填充流动池。这些液滴是通过少量水相形成的。这意味着微流控装置必须快速运行，以避免在形成正确尺寸的液滴之前损失全部水相。

填充后，使用瓦拉普（Valap）小心封闭流动池的两端。如果液滴仍在移动，则表明密封不完全，或可能引入了气泡。对于长期成像，将液滴转移至PDMS杯中，并覆盖一层油-脂混合物。

将中心体在室温下解冻，并置于37摄氏度环境中20分钟，以确保微管正常成核。在此期间，将检测混合液置于冰上预冷备用。该混合液应包含微管蛋白、GTP、氧气清除系统、分子力发生器（如微管交联蛋白）、ATP以及ATP再生系统。

混合后，将样品放入预冷的Airfuge转子中，在30 psi条件下离心3分钟。然后，向混合物中加入预热的中心体。优化加入的中心体数量，使每个液滴中含有一到两个中心体。

然后，使用该混合物制备乳液滴，方法如前所述。为了将动力蛋白招募至液滴皮层的生物素化脂质上，需将GFP-动力蛋白TMR和链霉亲和素加入水相中。在旋转盘共聚焦显微镜下，于26摄氏度孵育30分钟后观察微管的生长。

成像过程中，可通过将温度升至28甚至30摄氏度来促进微管生长。进行Z投影时，以1微米为间隔采集图像栈，每个液滴大约需要采集20张图像。进入主相机控制面板，点击“Edit Z”，将Z步进设为1.0。

单击“下一步”以保存设置。接下来，在采集面板中点击“相机”选项卡，将EM增益滑块调至300，以设置最大线性EM增益。然后，在同一选项卡中将曝光时间设置为200毫秒。

单击“记录”以保存设置。对于活体成像实验，将曝光时间缩短至约100毫秒，Z轴步进间隔增加至2微米，每两分钟进行一次Z轴投影，持续两小时。在活体成像实验中，为最大程度固定样本，请使用PDMS杯代替常规流动池。

利用所述方案，在含有中心体的水包油乳液滴中研究了星体的形成。最初，中心体在受限空间内自由扩散。大约20至30分钟后，可观察到第一批微管出现，随着微管向各个方向生长并与皮层接触，中心体的扩散受到限制。

当微管生长至超过液滴直径的一半时，中心体被推至液滴相对的边界，微管沿液滴皮层生长。在没有链霉亲和素的情况下，动力蛋白在液滴内呈弥散分布；然而，在液滴形成约10分钟后，若有链霉亲和素存在，动力蛋白便会与生物素化的脂质连接。

在存在皮层动力蛋白的情况下观察荧光标记的微管蛋白时，可以明显看到中心体位于中央位置。而在缺乏动力蛋白的情况下，中心体会被推向液滴的相对两侧。这可能是由于动力蛋白促进了微管的灾难性解聚以及皮层的牵拉力，从而导致星状微管阵列的中心定位。

观看本视频后，您应能充分理解如何利用微流控技术在球形乳液液滴中构建纺锤体样结构。一旦掌握该技术，正确操作时可在两到三小时内完成液滴生成与成像。通过该方法，还可将其他纺锤体组装因子包裹于液滴中，以研究其对纺锤体形态与定位的影响。

使用氯仿或聚二甲基硅氧烷（PDMS）时，应始终采取佩戴手套等预防措施。