同时可视化交联微管与单体微管的动力学行为 体外 通过全内反射荧光显微镜

细胞微管阵列包含具有不同动态特性的微管亚群，以满足其功能需求。本方案阐述了调控因子的协同作用如何赋予邻近微管亚群以独特性质。这种自下而上的重建实验使我们能够同时观察单根微管和微管束等邻近微管群体的组织结构与动态行为，并解析其自组织背后的机制。

多组分重建需要在保持各组分活性的同时，优化pH、离子强度和蛋白质浓度等实验参数。在进行多蛋白检测之前，对各个组分进行系统性分析极为重要。首先，将4.5微升BRB ADDTT与1微升微管溶液混合，用移液器将其滴加到显微镜载玻片上。

用 18 × 18 毫米的盖玻片覆盖，并用透明指甲油或 VALAP 封片剂密封边缘。将 TIRF 物镜置于盖玻片下方。在明亮混合液中，根据荧光标记的微管蛋白选择合适的激发波长，观察新聚合的微管，以确定后续实验中微管的稀释比例。

根据实验经验确定激光强度，确保所有荧光蛋白均被激发，但在实验过程中不会发生明显的光漂白。将显微镜温度设置为28摄氏度以观察动态微管。使用镜头纸蘸取70%乙醇清洁100倍物镜。

根据待成像的荧光通道，选择最佳的滤光片组和发射滤光片组合。设置成像序列。对于一项包含647纳米荧光染料标记的生物素化微管、可溶性微管蛋白中560纳米荧光染料标记的非生物素化微管以及GFP标记的目标蛋白的实验，每10秒对488纳米、560纳米和647纳米通道进行一次成像，持续20分钟。

在添加可溶性微管蛋白和微管相关蛋白之前，为束状结构采集参考图像，设置一个包含560纳米和647纳米波长通道各一幅图像的序列。检查显微镜上方天花板上激光束的位置，并使用软件调整光束。确保激光照明器已对准。

成像前，在物镜上滴加一滴显微镜浸油。将可溶性微管蛋白混合物置于冰上制备，并离心混合物。为通过生物素-NeutrAvidin-生物素连接固定微管，首先将约7.5微升NeutrAvidin溶液注入流动池直至充满，并孵育5分钟。

用10 µL MB冷液清洗。加入7.5 µL封闭蛋白KC，孵育2分钟。用10 µL MB温液清洗，以准备上样微管。

将生物素标记的微管蛋白储备液用BRB ADDTT稀释，取一微升该稀释液加入九微升预热的MB缓冲液中。将混合液注入反应室，孵育10分钟。用十微升预热的MB缓冲液洗去未固定的微管蛋白。

将7.5微升预热的KC缓冲液注入腔室，孵育2分钟。孵育期间，配制含有2纳摩尔浓度交联剂或蛋白PRC1的KC溶液，并离心该溶液。随后将10微升该溶液注入成像腔室，孵育5分钟。

制备微管束时，将10微升非生物素标记的微管注入反应腔，孵育10分钟。随后用10微升温热的MB缓冲液洗涤反应腔两次。在10分钟孵育期间，准备含有目标蛋白、可溶性微管蛋白、核苷酸、氧气清除剂和抗氧化剂的10微升反应混合液，并进行离心。

将混合物置于冰上。将固定在载物片架上的成像腔室置于100X TIRF物镜下。使用560纳米和647纳米通道寻找一个视野，其中含有适量且密度适宜的单根微管及微管束。

确定视野后，拍摄参考图像。小心地将检测混合物注入成像室，避免扰动成像室。使用VALAP密封剂密封成像室的开放两端。

观察微管并开始成像序列。在固定微管成核点并形成束状结构后，获取荧光图像。单个微管通过647纳米通道中的荧光信号进行识别，而当结构在两个通道中均显示荧光信号时，则被识别为预先形成的微管束。

在存在KIF4A和CLASP1蛋白的情况下，研究了单个微管以及PRC1交联微管束的动力学，结果显示单个微管在实验过程中持续延长，而交联微管的生长则受到抑制。注意保持聚合后的微管处于室温或更高温度；可溶性微管蛋白应置于冰上，并避免成像腔室及荧光标记的微管和蛋白暴露于光照下。

这些实验为有丝分裂纺锤体上的一种蛋白质模块如何差异性地调控共存于纺锤体中的两种不同微管群体的动态变化提供了机制性见解。