间隙连接细胞间通讯：一种用于评估毒物和毒素不良效应及天然产物健康益处的功能性生物标志物
2016年12月25日
本方案描述了一种使用手术刀加载荧光染料转移的技术，用于测量通过间隙连接通道的细胞间通讯。间隙连接介导的细胞间通讯是一种重要的细胞过程，对维持组织稳态至关重要，而此类细胞信号传导的中断会对健康产生不利影响。
总体目标是提供一种简单的检测方法，用于测量哺乳动物细胞群体中的间隙连接细胞间通讯，以满足广泛的体外药理学和毒理学研究需求。该方法有助于回答毒理学领域的关键问题，例如某种化合物是否通过干扰间隙连接细胞间通讯而影响组织的发育或稳态维持。该技术的主要优势在于，能够对大量细胞在接触毒物或毒素后，其间隙连接功能的变化进行简便且快速的评估。
演示该实验步骤的是我实验室的本科研究助理 Ajna Uzuni。实验开始时，将 3 × 10⁵ 个 WB-F344 大鼠肝上皮细胞接种至含有 Eagle 改良培养基和 5% 胎牛血清的 35 毫米直径培养皿中，每组三次重复。将细胞在培养箱中培养至 100% 汇合，随后继续进行细胞的实验处理。
为了继续进行剂量-反应实验，向三块细胞培养板（每块含2毫升培养基）中分别加入10微升和20微升先前配制的、溶于100%乙腈中的2毫摩尔母液，以及4微升、6微升和8微升溶于100%乙腈中的20毫摩尔菲（phenanthrene）母液，每种添加体积对应三块细胞培养板。接着，作为溶剂对照，向另外三块含2毫升培养基的细胞培养板中分别加入4微升、6微升、8微升、10微升和20微升的100%乙腈溶液，每种添加体积对应三块细胞培养板。加入乙腈后，将培养板置于培养箱中孵育。
为进行时间响应实验，将7微升浓度为20毫摩尔/升的菲（溶于100%乙腈）加入到三块细胞培养板中，每块培养板含2毫升生长培养基，对应每个时间点。然后，将7微升100%乙腈加入到另外三块细胞培养板中，每块培养板同样含2毫升生长培养基，作为溶剂对照。将各培养板在指定的时间点分别孵育。
轻轻倾倒弃去培养基。用三毫升磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗细胞，每次冲洗之间倾去或吸去液体。将一毫升浓度为一毫克每毫升的荧光黄染料（溶于PBS中）移液至每块细胞培养板中。
用拇指和食指夹住手术刀，将染料预加载到细胞中。将手术刀垂直置于培养板边缘外5毫米处，然后利用重力使手术刀从垂直位置轻轻滚动至15度角。在培养板的三个不同区域分别滚动刀片，穿过细胞群体。
接下来，在室温下用 LY 溶液孵育细胞 3 分钟。倾去或吸去 LY 溶液，并冲洗细胞以去除所有细胞外染料，消除细胞外背景荧光。然后，加入 0.5 毫升 4% 磷酸盐缓冲甲醛溶液以固定细胞。
使用倒置荧光显微镜在200倍放大倍数下观察固定的细胞。调整所有培养板的方向，使凹槽线与水平视野平行。一系列SL-DT图像由经不同浓度菲处理的WB-F344大鼠肝上皮细胞生成。
随着菲剂量的增加，荧光染料 Lucifer Yellow 的迁移减少，表明间隙连接细胞间通讯（GJIC）受到的毒性抑制作用逐渐增强。从 SL-DT 图像获得的对照组分数（FOC 值）经平均、统计分析后作图。按照此流程，还可进行其他方法，如单个转导蛋白的 Western 印迹，以回答更多科学问题。
例如，这些化合物是否正在激活细胞穿孔的有丝分裂原事件？
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概述
本方案描述了一种刀片加载-荧光染料转移技术，用于测量通过间隙连接通道的细胞间通讯。该方法提供了一种简单的检测手段，用于评估哺乳动物细胞中的间隙连接细胞间通讯，这对于理解组织稳态至关重要。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 毒理学
背景
- 间隙连接细胞间通讯对于维持组织稳态至关重要。
- 这种通讯的中断可能导致不良的健康效应。
- 该技术可实现对间隙连接功能的快速评估。
- 可广泛应用于多种药理学和毒理学研究中。
研究目的
- 检测化合物对间隙连接细胞间通讯的影响。
- 提供一种评估组织发育与维持的可靠方法。
- 促进毒理学研究中关于毒素对细胞通讯影响的研究。
使用的方法
- 将 WB-F344 大鼠肝上皮细胞接种于培养板中。
- 培养细胞至达到 100% 汇合度。
- 对细胞施加实验处理。
- 利用荧光染料示踪法评估细胞间通讯。
主要结果
- 该技术可用于评估大细胞群体中的间隙连接功能。
- 可揭示毒性物质如何影响细胞间通讯。
- 在多种体外研究中已证明其有效性。
- 快速简便的实验方案提高了研究效率。
结论
- 该方法是毒理学研究中的重要工具。
- 它有助于理解缝隙连接在组织健康中的作用。
- 未来的研究可进一步拓展其在药理学中的应用。
常见问题
行业重要性概述
间隙连接细胞间通讯（GJIC）可作为功能性生物标志物，用于评估毒性物质对组织稳态的破坏作用，并评价天然产物的保护效果。刀片划痕-荧光染料转移（SL-DT）技术能够实现对GJIC抑制的快速、群体水平评估，有助于在早期发现阶段进行机制性风险排除。该检测方法可通过化合物对维持器官功能至关重要的细胞通讯通路的影响，提供可靠的预测依据，从而优先筛选候选化合物。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过将化合物暴露与间隙连接介导的细胞间通讯（GJIC）功能障碍关联，揭示其作为毒性作用机制，从而验证治疗假说。
- 操作价值：通过直接测量活细胞群体中细胞间通道的功能活性，实现功能靶点的有效验证。
- 预测价值：通过识别对组织维持和稳态产生不良影响的早期生物标志物，支持药物研发管线的优先级筛选。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：通过建立间隙连接介导的细胞间通讯（GJIC）的基础能力，为后续实验流程提供经过验证的生物系统。
- 操作价值：提供可标准化的定量染料转移读数，适用于自动化和高通量成像分析。
- 可扩展性：可适用于体内组织切片，并可用于自动荧光显微镜检测，以提高样本通量。
转化与临床前研究
- 转化连续性：通过跨物种保守的间隙连接介导的细胞间通讯机制，将发现阶段的研究结果与临床前验证相连接。
- 机制性风险降低：明确所观察到的表型是否源于细胞间通讯的破坏，而非脱靶效应。
- 基于风险评估的决策：通过量化间隙连接介导的细胞间通讯调节中的构效关系，为推进研发提供决策依据。
流程与工作流整合
SL-DT 检测作为一种发现阶段的工具，用于提供机制性见解，在先导化合物优化之前用于筛选具有高组织破坏风险的化合物。
- 发现生物学：通过量化毒物或天然产物如何改变细胞间信号网络，支持假设验证。
- 筛选：提供可重复的、基于群体的功能性读数，反映组织水平的通讯，实现检测就绪。
- 分析：生成对照分数（FOC）值，支持在不同剂量和时间点之间的统计学比较。
- 转化研究：在临床前模型中，通过将间隙连接介导的细胞间通讯（GJIC）功能与组织完整性结果相关联，与生物标志物策略保持一致。
- 企业级复用：作为可重复使用的平台，广泛应用于毒理学、药理学和营养保健品研发项目中。
运营与企业影响
- 科学价值：通过直接检测缝隙连接通道活性的功能性读数，减少机制上的不确定性。
- 操作价值：采用简单的刀片加载和固定终点成像，确保实验的标准化与可重复性。
- 战略价值：通过将早期间隙连接介导的细胞间通讯（GJIC）破坏与后续不良组织效应相关联，改善决策判断。
- 组合影响：通过识别能够维持细胞间通讯稳态的化合物，实现基于风险调整的优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备细胞培养、荧光染料操作和落射荧光显微镜方面的专业知识。
- 依赖标准化的手术刀操作技术和一致的孵育时间，以确保染料转移的可靠性。
- 需要团队间在图像分析阈值和形态测量参数上达成共识。
- 通过优化染料加载和固定参数，可适用于多种哺乳动物细胞类型和组织切片。
- 仅限于评估通道功能活性；无法区分连接蛋白的表达、磷酸化状态或门控状态。
