在细胞外基质中构建三维上皮组织

本实验的目的是构建嵌入胶原凝胶中的、完全相同的三维组织，可用于多种实验场景，例如确定机械应力对分支形态发生的影响。该方法有助于回答组织形态发生领域的关键科学问题，例如揭示集体细胞行为的潜在机制。该技术的主要优势在于所构建组织的几何形状可控且可重复，从而能够对物理和生化因素进行精确操控和定量测量。

因此，样本量足够大，可使结论具有较高的统计学可信度。首先，使用标准的光刻技术制备带有目标阵列图案的硅模板。本视频中使用的图案由矩形结构组成，相邻结构间距为200微米。

接下来，将预聚物与固化剂按10:1的比例在一次性培养皿中混合，配制50克PDMS。然后将混合物置于真空环境中15至30分钟，以去除混合过程中引入的气泡。将硅胶母模的纹理面向上放入塑料称量舟中，然后将脱气后的PDMS溶液倒在模具表面。

然后，将培养皿放入烘箱中，在 60 摄氏度下固化 PDMS 12 小时。固化完成后，从塑料容器中取出 PDMS 及其模具。小心地将 PDMS 从硅片上剥离。

然后，使用干净的刀片将印模特征周围多余的PDMS切除。接着，用刀片将已形成图案的PDMS切割成单独的矩形印章。将这些印章正面朝上存放于洁净的直径100毫米的培养皿中。

接下来，使用预聚物与固化剂按10:1的相同比例配制新鲜的脱气PDMS溶液。将2至3克该溶液旋涂到直径为100毫米的培养皿上，然后在60摄氏度下固化PDMS 12小时。随后，使用剃刀刀片将PDMS薄层切割成矩形，作为印章的支撑基底使用。

每个印章需要两个支撑物。将所有支撑物切割完成后，在生物安全柜中将其与PDMS印章一同浸入70%乙醇中进行灭菌，并使用抽吸装置干燥。在生物安全柜中，向每个印章的顶部加入50 µL含1% BSA的PBS溶液。

将覆盖有液滴的印模置于 4 摄氏度环境中至少四小时，以确保 BSA 吸附至印模表面。随后，将印模放回生物安全柜中，吸除 PDMS 印模上的 BSA 溶液。接着，用 50 微升细胞培养基将印模表面清洗两次。

每次洗涤后吸除培养基。为每个PDMS印章准备一个直径35毫米的组织培养皿。在每个培养皿中，放置两个PDMS支撑物，其间隔距离略小于PDMS印章的长度。

然后，使用镊子夹取直径为15毫米的玻璃盖玻片，并用70%乙醇进行灭菌。用镊子夹住盖玻片，吸去多余的液体，随后将其存放于单独的培养皿中。接下来，将50微升浓度为4毫克/毫升的胶原蛋白混合液直接滴加到每个印章上，以均匀涂覆PDMS印章的表面。

使用镊子夹起每个包被胶原的PDMS印章，并轻轻翻转。将翻转后的印章胶原面朝下放置在培养皿中的PDMS支撑物上。然后在37摄氏度下孵育30分钟。

接下来，将50微升剩余的胶原蛋白混合物分别加入每个圆形盖玻片上，并在37摄氏度下孵育30分钟。此时，收集你感兴趣的细胞类型。此处我们使用的是EpH4小鼠乳腺上皮细胞，将其悬浮于浓度为每毫升100万至1000万个细胞的溶液中。

现在，将凝胶化的胶原样品从培养箱中取出。使用镊子轻轻将PDMS印章垂直向上提起，使其脱离模制的胶原并弃去。必须垂直向上提起印章，以避免扭曲胶原凝胶中的结构特征。

将30微升浓缩的细胞悬液分别加入含有所需几何形状模制腔的胶原凝胶表面。轻轻左右摇晃培养皿，同时在明场显微镜下观察细胞，以促进细胞沉降到腔内。腔体应在五分钟内填满。

为去除腔隙周围的过量细胞，将每个组织培养皿倾斜放置，轻轻将400微升细胞培养基 dispense 至胶原凝胶表面。洗涤时需注意：在倾斜培养皿的同时缓慢加入培养基，以去除凝胶表面的过量细胞，同时避免移位凝胶腔隙内的细胞。吸除液体后，重复洗涤两次。

在每次清洗间隙，使用显微镜检查胶原凝胶，以观察过量细胞是否已被冲洗干净。当细胞填充的腔隙周围过量细胞被清除后，将培养皿置于37摄氏度的培养箱中孵育15分钟。随后，用镊子轻轻翻转涂有胶原的玻璃盖玻片，并将其放置在细胞填充的胶原模具上方，使盖玻片上的胶原覆盖于细胞填充的腔隙之上，形成封闭结构。

将样品在 37 摄氏度下孵育 15 分钟。待胶原蛋白盖片与含有细胞的胶原模具粘附后，缓慢地在凝胶上方的玻璃盖玻片上加入 2 至 2.5 毫升细胞培养基，于 37 摄氏度培养 1 至 3 天。这些图像为在接种细胞前，成型于 I 型胶原凝胶中的阵列在低倍和高倍镜下的观察结果。

孔的形状由硅模板上结构的形状决定。此处，矩形孔中已填充乳腺上皮细胞。本示例中，每个200 × 50 微米的矩形孔包含约80至100个细胞。

细胞接种24小时后，可观察到细胞在孔内相互黏附，形成组织。在培养基中加入生长因子HGF 24小时后，可见组织发生分支形态发生。参与细胞迁移的蛋白之一是黏着斑激酶，从这张复合图像中可以看出，该蛋白在孔的末端区域表达增加，而这些区域通常是分支发生的部位。

一旦掌握，若操作得当，该技术可在两小时内完成。在完成该步骤后，可进一步开展其他方法，如牵引力显微镜、实时定量 RT-PCR 和蛋白质印迹（Western Blotting），以测定细胞迁移过程中施加的力学力以及目的基因转录水平和蛋白水平的变化。观看本视频后，您应能够充分理解如何建立这种三维细胞培养模型，即将具有确定初始几何形状的组织包埋于胶原凝胶中。

感谢观看，祝您的实验顺利。