通过构建单个合成卷曲菌毛操纵子工程化黏附性细菌

以下实验的总体目标是赋予细菌黏附特性，以促进其从液体培养基中的分离。首先通过设计一种合成的卷曲纤维，绕过复杂的基因调控，从而实现黏性多聚体的简易且大量生产。第二步是在聚苯乙烯表面可视化并定量具有黏附性的细菌，以便快速评估该合成装置的效率。

接下来，通过共聚焦显微镜在玻璃表面观察黏附的细菌。为了直接观察生物膜并获取其结构信息，实验结果表明，携带合成装置的菌株在黏附程度和黏附百分比测量以及显微观察方面均显示出显著增强的黏附能力。相较于传统克隆等现有方法，合成生物学方法的主要优势在于，能够快速获得仅包含绝对必需基因及适当调控信号的构建体。

该方法有助于回答生物修复领域中的一个关键问题，例如解决从放射性废物中去除负载金属的细菌的难题。通常，刚接触该方法的研究人员会遇到困难，因为需要具备基因调控信号和数据库操作方面的基础知识。可视化演示将重点展示生物膜的定量分析与可视化，因为这两个步骤由于生物膜结构的脆弱性而极难掌握。

设计合成卷曲菌毛的第一步是确定卷曲基因的遗传结构，并定位其内源性的转录和翻译信号。这一步可通过使用专门的数据库（如 REON DB 或 eco gene）来完成。下一步是选择合成卷曲菌毛所必需的五个基因：CSGB 和 CSGA 负责编码纤维单体，而 C-S-G-E-C-S-G-F 和 CSGG 则编码卷曲分泌复合物。从数据库中提取所选序列后，将以 FASTA 格式进行数据管理，并使用 Clone Manager 软件进行计算机预分析，因为 C-S-G-G-F-E 基因簇在大肠杆菌基因组中为反义链。

该序列需要转换为其反向互补序列。使用克隆管理工具中的操作流程“分子反转”，通过连接功能将C-S-G-E-F-G序列粘贴至C-S-G-B-A之后。接下来，在C-S-G-B-A-E-F-G iCal序列前端添加适当的启动子PRCN。

RCN 基因座编码一种 FLX 泵 RCNA，负责镍和钴的解毒，以及其对应的金属调节蛋白 RCNR。在没有钴或镍的情况下，阻遏蛋白 RCNR 会结合到 DNA 上的 RCNR 结合位点，阻止下游基因的完全转录激活。当细胞内钴或镍浓度升高时，钴或镍与 RCNR 蛋白结合，阻止阻遏蛋白与启动子结合，从而使 P-R-C-N-A 的转录活性增强，将五个选定的卷曲基因置于该启动子的调控之下。

预测在钴和镍存在的情况下，PRCN 卷曲蛋白的产量会过高。随后通过在 CS gba DNA 序列的第一个 ATG 前添加一个完美的核糖体结合位点（RBS），以及在 C-S-G-E-F-G 序列前添加第二个完美的核糖体结合位点（RBS），来优化转录信号。为了符合 IGMs 标准，该装置必须在两侧分别带有标准生物砖前缀和后缀：前缀包含 ECO R one 和 X-bar one 的限制性酶切位点，后缀包含 SPE one 和 PST one 的限制性酶切位点，以方便后续组装。

生物砖部件本身不应包含任何EcoR I、Pst I、Spe I和XbaR I的识别位点。因此，通过计算机中的限制性分析发现，CSGA序列中存在一个Pst I位点，RCNR序列中存在一个Pst I位点，CSGE基因中存在一个EcoR I位点。这些位点已通过同义突变进行修饰。

合成基因序列设计完成后，使用克隆管理软件进行翻译模拟。利用序列比对程序 blast 验证野生型卷曲蛋白与合成基因所编码蛋白之间是否完全同源。对 24 孔聚苯乙烯板的每个孔进行如下操作：加入 2 毫升含 0.2% 葡萄糖的 M63 最小培养基，并接种 10⁶ 个过夜培养的细菌细胞。将细菌在 30°C 条件下静置培养 18 至 48 小时。24 孔板的每一列代表一种处理方式。

根据需要加入适量的钴和抗生素。前3行用于通过3次重复实验的平均值来定量A类黏附细菌。24孔板前3行每孔中的上清液含有浮游细胞，需将其收集并转移至溶血管中，剩余的最后一行则用于在18至48小时后通过结晶紫染色观察生物膜。

用一毫升 M 63 培养基小心冲洗每个孔，并用初始上清液将洗涤液收集至溶血管中。此收集液称为游动细胞，记为 S。微孔板各孔底部附着有黏附细胞。为回收生物膜，向每个孔中加入一毫升 M 63 培养基。

用移液器枪头刮取细胞，反复吹打混匀，然后将生物膜组分转移至新的溶血管中。涡旋振荡管子15秒。将生物膜组分收集至溶血管中。

该菌池代表贴壁生长的细胞，称为B。从溶血管中转移200微升上清液及生物膜组分至96孔板中。通过在600纳米处测定光密度，估算贴壁细菌和游动细菌的数量。每种处理方式的黏附率按以下公式计算：B乘以100除以（3倍S加B）。为了仅对24孔板最后一行的生物膜进行可视化观察，需弃去这些孔中的浮游细胞。

向每个孔中加入一毫升 M 63，以冲洗在孔底形成的生物膜。将未加盖的板在 80 摄氏度下干燥一小时。一小时后，向每个孔中加入 100 微升 20% 结晶紫溶液，作用两分钟，随后用大量水充分洗涤。本方案需要使用荧光底盘菌株。

携带合成卷曲菌毛基因的质粒的合适宿主是大肠杆菌（E. coli）SCC1 菌株，该菌株组成型表达绿色荧光蛋白，且与亲本菌株 MG1655 无明显差异。将携带合成卷曲菌毛的 pUCK57 质粒转化至宿主菌株中，以获得 S23 菌株。将对照质粒 pUCK18 转化至宿主菌株中，以获得对照菌株。

将 S 23 和 S 24 菌株的预培养物在 30 摄氏度下于添加了葡萄糖和氨苄青霉素的 M 63 培养基中过夜培养。次日，在培养皿中加入 20 毫升 M 63 培养基，然后取 100 微升预培养物接种至含 15 毫升 M 63 培养基的培养皿中。加入适当浓度的钴，并设置不含钴的阴性对照。

向每个培养皿中放入三块矩形玻璃盖玻片。在30摄氏度下静置培养过夜。随后几天可直接在荧光显微镜下观察细菌。

避免样品干燥非常重要，因此以下步骤必须小心且迅速地进行。将每个盖玻片从培养皿中取出并小心沥干。用浸有70%乙醇的小棉签仔细擦拭其底面，以清除所有细菌残留物，便于共聚焦观察。

将盖玻片放置在载玻片上，使覆盖有生物膜的一面朝上。然后用更大的盖玻片覆盖生物膜，并用清漆将盖玻片固定在载玻片上。

将装置倒置，使生物膜位于下表面。在此实验中，将装置置于共聚焦激光显微镜下。本实验采用CT微平台内的Zeiss LSM 510 meta共聚焦激光显微镜。

选择40倍油镜物镜。使用以下设置：在488纳米波长下激发GFP，并在500至600纳米范围内收集细菌荧光信号。使用40倍油镜物镜进行图像采集。

在激光扫描共聚焦模式下，从固体表面到培养基界面，以1微米为步长，扫描生物膜的整体三维结构。

使用maus软件进行三维投影，通过分析统计学纵向切面的平均C值来确定生物膜厚度。生物膜的定量分析以及生物体积可从共聚焦Z层扫描图像中提取。可通过简单方法评估大肠杆菌在响应金属刺激而过表达卷曲菌毛后的黏附能力。

例如，在24孔抛光Irene板上进行结晶紫染色，可快速观察到每个孔底部生物膜形成的程度，表现为紫色深浅的差异。结果显示，野生型菌株的黏附能力弱于工程菌株。一种定量方法是测量野生型和工程菌株在不同浓度钴存在下对聚苯乙烯表面的黏附百分比。

该图所示结果表明，在无钴条件下，工程菌株的黏附率比野生型菌株高1.5倍。此外，在含钴培养基中，随着钴浓度增加，黏附能力显著增强；当钴浓度为25 µM或50 µM时，工程菌细胞的黏附率分别达到30%和40%。还可通过显微镜比较黏附能力：将表达GFP标记的细菌在玻片上培养后，利用落射荧光显微镜在黑色背景下观察绿色细菌，结果显示工程菌株形成生物膜，而野生型菌株仅形成微菌落，如箭头所示。

共聚焦显微镜分析可提供生物膜三维结构的整体视图。A图显示顶视图重建结果，B图显示侧视图重建结果。结果证实，工程菌株比野生型具有更强的黏附性，并形成更致密且更厚的生物膜。在进行该实验操作时，务必仔细检查实验设计，例如，在放射性废水处理背景下，探究经修饰的大肠杆菌或蚁生菌的生物介导潜力。

观看本视频后，您应能够充分了解如何使用 Clone Manager 软件设计合成引物，以及如何快速定量细菌菌株的表达水平。请务必注意，操作合成基因和转基因生物可能具有极高危险性。实验必须遵守现行法律法规，操作过程中应始终采取必要的预防措施，例如对转化后的细菌进行高压灭菌处理。