Anopheles gambiae 胚胎的显微注射方法

本方案具有重要意义，因为它提供了一种针对冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）的特异性显微注射方法，而该物种历来难以通过常规基因工程技术进行转化。该技术的主要优势在于能够稳定地创制转基因冈比亚按蚊。该技术的应用前景涵盖疟疾根除的新策略，通过创制适用于种群压制或改造野生型冈比亚按蚊种群的蚊子，推动相关研究的发展。

该方法可轻松适用于不同的蚊虫种类。我们的显微注射技术需要耐心和练习，存在一定的学习曲线。

首先，使用吸虫器将20至30只雌蚊放入一个透明的50毫升锥形管中。确保该管两端均被切开，一端覆盖乳胶牙科膜，另一端覆盖尼龙网和滤纸，蚊子将在该端产卵。将装有蚊子的管子置于盛有双蒸水的小型培养皿中，然后将管子和培养皿放入28°C的培养箱中孵育45分钟。

从培养箱中取出试管，将其插入一个空的笼子中。轻轻敲击试管，使蚊子飞出。待所有蚊子都飞出后，将试管从笼子中移除。

当管内无蚊子时，拧开底部环，取下尼龙网，并用镊子小心地将带有卵的滤纸从管中取出。将附有卵的滤纸放入一个塑料培养皿中，培养皿内预先放置一层用水润湿的滤纸。取一张膜置于干净的载玻片上，用干净的镊子将一小片滤纸覆盖在膜上，保留约一毫米的膜过滤区域不被覆盖。

用去离子水润湿滤纸，然后用刷子轻轻将30至50个胚胎转移到膜的边缘，并沿膜垂直排列卵子。将卵子朝向同一方向摆放，以便在显微注射显微镜下观察时，卵子的后端朝下，并与注射针成15度角。沿膜的整个边缘排满卵子。

使用微载样头吸取两微升（2 µL）DNA 混合物以填充针头。将针头插入针座，并连接自动压力泵管路。调整针头方向，使其与载玻片平面成 15 度角。

通过轻轻触碰第一个卵子来打开针尖，然后将针尖插入卵子后极约10微米处。成功的注射会导致卵子内部细胞质出现轻微移动。使用显微镜同轴载物台控制装置移动至下一个卵子，继续注射。

为确保针尖保持通畅且未堵塞，在进入另一个胚胎前按下“注射”按钮，并观察针尖开口处形成的小液滴。如果针尖发生堵塞，请按下“清除”按钮以疏通针尖，并重复进行液滴观察测试。若针尖开口略有变大，可根据需要调整压力，以确保液滴大小保持较小。

每根针注射约40至50枚卵。注射完成后，将卵冲洗至一个内衬滤纸并装有50毫升去离子水的玻璃容器中。采用此方案，已将一个自主基因驱动系统插入到冈比亚按蚊G3实验室品系的生殖系中。

该系统旨在靶向该物种第三条染色体上的核心直系同源基因（Agcd）。图示为质粒pCO37，其包含受nanos基因直系同源物调控元件控制的化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes）Cas9内切酶。

此外，该系统包含一个由U6基因启动子调控的引导RNA，以及一个表达青色荧光蛋白的3XP3 CFP显性标记盒。分子学方法证实了约10千碱基对DNA的准确插入，该序列被命名为AgNosCd-1。后续的深入分析表明，AgNosCd-1在基因驱动中效率很高，产生的抗性等位基因极少，并且由于基因驱动系统的整合与表达未引起显著的遗传负荷。

携带纯合基因驱动的蚊子为功能缺失型突变体，其幼虫、蛹和新羽化的成虫均表现为红眼表型。在实施本方案时，将温度维持在88至关重要，以确保良好的孵化率，获得浅灰色虫卵，并避免出现白色虫卵。