应用不可渗透屏障结合候选因子浸泡微珠研究鸡胚中的诱导信号

本手术干预的目的是通过阻止信号分子从内侧组织扩散到侧板中胚层细胞，从而阐明鸡胚肢体诱导的机制，并研究其对基因表达的影响。该方法有助于回答发育生物学中的关键问题，例如，控制肢芽起始的诱导信号是什么。该技术的优点在于鸡胚易于进行手术操作且生命力强，此外，未手术的对侧对照肢芽可作为非常有效的内部对照。

Susan Wilde 将演示该操作步骤。首先，剪取一块边长为 1 cm、厚度为 0.013 mm 的铝箔，用 70% 乙醇擦拭进行灭菌。然后，将铝箔放置于一个 6 cm 的无菌塑料培养皿中。

为防止静电吸附，丢弃原有盖子，并用同一片铝箔为培养皿制作一个新的盖子。接着，将培养皿置于双目显微镜下的载物台测微尺上，显微镜放大倍数设为1.6倍。使用15号小型解剖刀切割铝箔，制成宽1.3 mm、长2 mm的铝箔条。

使用两把4号钟表匠镊子将箔条分开。然后，在箔片屏障的中心处弯折成直角，使其形似一个铰链。将这些屏障排列在培养皿的中央，使一侧紧贴培养皿底部，另一侧竖直向上伸出培养皿。在操作日前，预先制备20个或更多的屏障。

将铝箔盖盖在培养皿上，将屏障放置在不会被扰动的地方。将鸡蛋侧放，用一只手稳固地握住一对AA型强力镊子，另一只手固定鸡蛋，以受控的刺入动作刺破含有气室的钝端。确保已刺破内壳膜。

接下来，用双手握住鸡蛋，沿其水平轴旋转180度。然后取一块透明胶带，大小约为5 cm见方，将其紧密贴在鸡蛋最上表面，以防止打开鸡蛋时蛋壳碎屑落入胚胎。使用一把弯头剪刀，轻轻在鸡蛋最上部中央位置剪破蛋壳及其下方的内层细胞膜。

用剪刀的一侧刀刃在蛋壳上刺一个非常小的孔，使空气能够通过该孔进入胚胎上方的蛋内。用剪刀将蛋壳上的孔扩大成直径约1 cm的圆形，移除该片蛋壳。

用一块约5厘米见方的透明胶带盖住蛋上的孔。仅将胶带边缘压紧在孔口，使其粘牢，其余部分保持松散。这样便可轻松抓住松散的胶带，方便打开蛋壳。

从培养箱中取出一个15期胚胎，将蛋置于解剖显微镜下的蛋托上，显微镜放大倍数设为3.2倍或更高。随后，移除上层透明胶带。使用钢制显微刀，在胚胎右侧体节26-32附近，切开卵黄膜及侧板中胚层。

用5号显微镊夹住屏障的一端，扭转屏障以将自由端插入切口。尽快用透明胶带密封蛋体，并将其放回培养箱中。如果需要同时插入珠子，请首先按照随附文本方案中所述的方法制备浸泡过视黄酸的珠子。

接下来，取微珠和一对5号显微镊子，将其插入切口远端侧中胚层的切面。然后，将屏障插入微珠近端的切口内。封闭蛋壳，并立即将其放回培养箱中。

如果需要在无屏障的情况下插入一个或多个珠子，则无需制作长切口。相反，应在预定放置珠子的位置，通过卵黄膜在侧板中胚层上做一个小切口。然后，取珠子和5号显微镊，将其插入侧板中胚层的孔洞中。

用镊子的闭合端将其再向内推进一点。从培养箱中取出一个窗口化孵育10期的胚胎，将蛋置于双目显微镜下的蛋托上，显微镜放大倍数调至3.2倍或更高（根据需要）。然后，使用钢制显微刀，在胚胎尾端原条外侧，沿体节方向，切开卵黄膜和侧板中胚层，切口长度约为六个体节的长度。

接下来，用5号显微镊夹住屏障突出于培养皿外的一端，并旋转手腕，将屏障的游离端插入切口。尽快用透明胶带密封蛋壳，并将其放回培养箱。如果需要在不使用屏障的情况下插入小珠，则在预定放置小珠的位置，通过卵黄膜切开一个小切口，进入侧板中胚层。

然后，取珠子和一对5号显微镊，将其插入侧板中胚层的孔中。最后，用镊子闭合的末端将珠子进一步推入。图中显示的是15期胚胎体节26-32预定腿部水平处屏障的位置。

这一屏障导致在操作侧的肢芽区域中 Fhf10 和 Fhf8 的表达均缺失，而在未操作的左侧则存在表达。然而，在操作侧的第19期和第23期均能观察到 Tbx4 的表达。这表明仅 Tbx4 的表达不足以启动来自侧板中胚层（lpm）的后肢外生生长。

当在15期将浸有视黄酸的琼脂珠置于屏障远端时，手术侧的 Tbx4、Fgf10 和 Fgf8 均表达，与左侧对照侧相同。因此，在正常发育过程中，体节来源的视黄酸是肢体芽起始前必不可少的因素。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用不可渗透屏障和浸有候选因子的琼脂珠，研究诱导信号在鸡胚中如何调控肢体芽的起始。