利用浸润珠实验分析鸡胚胎发生过程中的细胞分化、形态发生与图式形成

该实验方法使学生能够通过将微珠植入胚胎的不同区域，观察细胞分化和形态发生等多种发育过程中的特定分子。本方案可应用于任何实验动物模型、细胞培养、类器官型模型（包括类器官）。此外，该方法也是向学生讲授基础发育生物学知识的有益教学工具。

演示该实验操作的是来自实验室的本科生 Alexandra Gonzales-Gonzales。首先，将受精的白来航鸡鸡蛋尖端朝下垂直放入恒温培养箱中，在38摄氏度、70%相对湿度的湿润环境中孵育。当胚胎发育至 Hamburger 与 Hamilton 分期的第28期时，从培养箱中取出鸡蛋，用70%乙醇浸泡并静置使其自然晾干。

然后用70%乙醇对工作区域、显微镜和仪器进行消毒。接着对鸡蛋进行照蛋，以识别血管并定位胚胎。丢弃不含胚胎的鸡蛋。

使用无齿镊子的末端，轻敲鸡蛋的钝端以打开一个窗口，并移除约一平方厘米的蛋壳部分。然后，将鸡蛋转移至纸板盒或塑料支架中，并置于体视显微镜下。使用精细的手术镊子，除去可能接触胚胎的任何微小蛋壳碎片，并通过穿刺并拉出的方式去除气室膜。

接下来，使用精细的外科镊子轻轻撕开羊膜囊，注意不要损伤绒毛尿囊膜的血管系统。在蛋内对胚胎进行分期，以确定其是否处于所需阶段。对于Affi-gel肝素珠的制备，裁剪一块方形的Parafilm膜，使其能够放入45毫米的培养皿中。

将Parafilm覆盖在培养皿底部后，用无齿镊子的末端将每个角推压至培养皿底部并固定。接着，使用移液器或刮勺将珠子转移至微量离心管中，用PBS洗涤两次，每次洗涤时让珠子自然沉降，然后吸除上清液。随后，使用微量移液器将40到50个珠子转移至覆盖Parafilm的培养皿中央。

在显微镜下，选取30个直径为100微米的Affi-gel或肝素珠。以28期胚胎的第三指（趾）间区域作为参考来确定珠子大小。珠子必须小于指（趾）间区域。

小心去除选定磁珠周围多余的 PBS 后，将其浸入 2 至 5 微升的处理溶液中。在室温下孵育磁珠 30 分钟。孵育期间，为防止磁珠干燥，可在磁珠周围滴加少量 PBS 或水以湿润局部环境，并用封口膜覆盖培养皿以减缓蒸发。

倒入 AG1X2 液滴制备液。使用刮勺将液滴转移至微量离心管中，并加入 50 微升所需终浓度的处理溶液。用铝箔包裹试管以避光，于缓慢振荡条件下孵育 20 分钟。

孵育后，使用移液器尽可能吸除处理溶液，加入溶解于水中的0.2%酚红溶液，轻度振荡染色两分钟。染色后，去除染料，然后用PBS洗涤珠子两次，以去除任何残留染料。接下来，使用微量移液器吸头将40至50个AG1X2珠子转移至覆盖对苯二甲醛的培养皿中心，并加入5微升PBS浸泡珠子。

然后在显微镜下挑选约30个直径为100 µm的微珠。将选出的微珠浸入实验溶液中，并在微珠周围滴加少量PBS或水，以湿润局部环境。用封口膜覆盖培养皿，以减缓蒸发。

在操作胚胎之前，将两台体视显微镜并排放置在实验台面上。然后，使用无齿镊子在剩余的卵壳上开一个窗口。接着，在显微镜下用精细的外科镊子撕开靠近右侧后肢的羊膜。

用精细镊子夹住胚胎的羊膜，以暴露右侧后肢。然后使用细钨针，在后肢第三指间最远端的中央打一个小孔。在不松开胚胎和暴露的后肢的情况下，用镊子的一个尖端从另一台显微镜下取一个已处理的琼脂糖珠。

镊子必须张开，使一个珠子粘附在其尖端。将珠子转移至靠近后肢的鸡胚中，将其置于指间孔的上方。通过闭合镊子对珠子施加压力，直至其进入孔中。

然后释放胚胎，用胶带密封蛋壳窗口，并将鸡蛋放回培养箱中，直至达到所需发育阶段。为确保检测的有效性，必须将凝胶珠 consistently 且精确地放置于正确位置。在本研究中，浸泡过的凝胶珠被置于顶细胞外胚层脊下方第三指间区域最远端。

可通过茜素红和海洋蓝对胚胎进行染色，以显示骨骼结构的形成并评估对细胞分化的效应。该检测方法也适用于利用中性红评估细胞死亡以及通过C2杂交评估基因调控。该实验工具的主要优势在于能够控制浸泡珠子的时间和位置。

将核心定位与精确的发育时间相结合，为研究细胞分化过程提供了巨大的可能性。